БИОЛОГИЯМОРЯ, 2015, том 41, № 1, с. 55-63
УДК 597.5+577.1+574.2 СРАВНИТЕЛЬНАЯБИОХИМИЯ
ОСОБЕННОСТИ ОРГАНИЗАЦИИ БЕЛКОВ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНОЙ ФРАКЦИИ ПЛАЗМЫ У ДАЛЬНЕВОСТОЧНЫХ КРАСНОПЕРОК РОДА TRIBOLODON
И ДРУГИХ CYPRINIDAE1
© 2015 г. А. М. Андреева1", М. В. Серебрякова2, Н. Е. Ламаш3 4, Р. А. Федоров1, И. П. Рябцева1
'Институт биологии внутренних вод им. И.Д. ПапанинаРАН, п. Борок 152742; 2Москоеский государственныйуниверситет им.М.В. Ломоносова,Москва 119991; 3Институт биологии моря им.А.В. ЖирмунскогоДВО РАН, Владивосток 690041;
Дальневосточный федеральныйуниверситет, Владивосток 690950 *e-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru
Статья принята к печати 22.05.2014 г.
На примере дальневосточных красноперок рода Tribolodon и других представителей семейства Cyprinidae исследована организация низкомолекулярной (НМ) фракции плазмы рыб. Установлен единый принцип организации НМ-фракции, в соответствии с которым она содержит две подфракции: первая из олигомерных, а вторая из мономерных белков. В период подготовки рыб к нересту в первой подфракции отмечено снижение кажущейся молекулярной массы белков вследствие изменения структуры олигомеров, а во второй подфракции зарегистрировано резкое снижение гетерогенности белков. Анализ этих перестроек позволил выявить два основных типа организации НМ-фракции плазмы - "базовый" и "пластический". Первый характеризует невысокий уровень обменных процессов, второй - их активацию в период подготовки к нересту. Использование масс-спектрометрии MALDI позволило идентифицировать в составе подфракции олигомеров полимерные формы аполипопротеинов, фетуина и альбуминоподобного белка, в подфракции мономерных белков - гемопексин и ингибиторы протеиназ.
Ключевые слова: низкомолекулярные белки плазмы крови, карповые рыбы, 2Б-электрофорез, масс-спектрометрия MALDI.
Structural features of the low-molecular-weight plasma fraction in Far Eastern redfins of the genus Tribolodon and other cyprinid fishes. A.M. Andreeva1, M.V. Serebryakova2, N.E. LamashX4, R.A. Fedorov1, I.P. Ryabtseva1 (4.D. Papanin Institute for Biology of Inland Waters, Russian Academy of Sciences, Borok 152742; 2Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991; 3A.V. Zhirmunsky Institute of Marine Biology, Far East Branch, Russian Academy of Sciences, Vladivostok 690041; 4Far Eastern Federal University, Vladivostok 690950)
The organization of the low-molecular fraction (LMF) of proteins from fish plasma is studied in Far Eastern redfins of the genus Tribolodon and other representatives of the family Cyprinidae. The common principle of organization of plasma LMF is established. According to this principle, the LMF includes two subfractions: oligomeric and monomeric proteins. During the pre-spawning period, a decrease in the apparent molecular weight of proteins as a result of changes in their oligomeric structure is observed in the former subfraction; a reduction of heterogeneity of proteins, in the latter subfraction. The analysis of these rearrangements allows differentiating two main types of the LMF: "basic" and "plastic". The former type is characterized by a low level of metabolic processes; the latter one, by their activation during the pre-spawning period. By using MALDI mass spectrometry, polymeric forms of apolipoproteins, fetuin, and albumin-like protein were identified within the oligomeric subfraction; hemopexin and inhibitors of proteinases, within the monomeric subfraction. (Biologiya Morya, 2015, vol. 41,no. 1, pp. 55-63).
Keywords: low-molecular proteins ofblood plasma, Cyprinidae, 2D-electrophoresis, MALDI mass spectrometry.
Единообразие фракционного состава белков плазмы у позвоночных было постулировано в середине прошлого столетия (Tiselius, 1937; Moore, 1945; Deutsch, McSchan, 1949). Несомненно, определяющую роль в установлении данного постулата сыграло развитие высокоэффективных методов разделения сложных смесей биологических молекул, и прежде всего электрофореза. Так, с помощью 20-электрофореза плазму позвоноч-
ных, в том числе рыб, удалось дифференцировать на несколько десятков белков, сгруппированных во фракции (Anderson, Anderson, 1977; Sickmann et al., 2002; Mäjek et al., 2011, 2013; Babaei et al., 2013). При использовании более сложных подходов, включающих электрофорез, трипсинолиз, хроматографию и масс-спектрометрию, как у млекопитающих, в том числе и человека (Anderson, Anderson, 2002; Anderson et al., 2004; Bouwman et al.,
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект 13-04-00427-а).
2011; Luczak et al., 2011), так и у рыб (Lucitt et al., 2008) в плазме было обнаружено более тысячи полипептидов -продуктов отдельных генов.
В эволюции позвоночных все основные фракции плазмы появились или формировались у представителей низших таксонов, в том числе у рыбообразных и рыб. Особое место занимает низкомолекулярная (НМ) фракция плазмы. У млекопитающих в ней доминируют альбумины (Тинаева и др., 2007), у рыб - близкие им по свойствам альбуминоподобные (АП) белки (Андреева, Федоров, 2010; Andreeva, 2012). Помимо структурных особенностей АП-белков НМ-фракцию плазмы рыб отличает множественность (гетерогенность) (Кирпичников, 1987), функциональная целесообразность которой не вполне понятна.
Карповых рыб в качестве объекта для изучения организации НМ-фракции плазмы мы выбрали не случайно, так как многие представители этого семейства являются объектами рыбоводства, к тому же им в полной мере присуща множественность НМ-фракции плазмы (Andreeva, 2012). Немаловажно и то, что в данном семействе есть виды с секвенированными геномами. Это позволяет надеяться на успех идентификации белков и у видов, геномы которых не секвенированы, и которые, как правило, являются объектами экологических и биохимических исследований (Armengaud et al., 2014; Papakostas et al., 2014). Учитывая широкое использование белков в качестве маркеров состояния организма, их идентификация и протеомное картирование представляются также перспективными для оценки состояния здоровья рыб.
В данной работе, исследуя особенности организации НМ-фракции плазмы у разных представителей семейства Cyprinidae, мы систематизировали разнообразные способы организации НМ-фракции плазмы в ходе годового цикла рыб и провели инвентаризацию белков фракции с помощью масс-спектрометрии MALDI.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Множественность белков НМ-фракции плазмы рыб оценивали в зависимости от сезонной и репродуктивной динамики, после чего фракции систематизировали по параметру гетерогенности, локализации подфракций в электрофорезе и по молекулярной массе (Мм) белков подфракций. Белки идентифицировали с помощью масс-спекгрометрии и выясняли, к какому функциональному классу они принадлежат; как дополнительный фактор множественности фракции оценивали структурное разнообразие белков по типу мономер/олигомер.
В работе были использованы представители отряда Cypriniformes, семейства Cyprinidae: два вида дальневосточной красноперки - крупночешуйная Tribolodon hakonensis (Gunther, 1880) и мелкочешуйная Т. brandtii (Dybowskii, 1872), отловленные в зал. Восток Японского моря и в устье р. Раздольная; mm,Abramis brama (Linnaeus, 1758), плотваRutilus rutilus (Linnaeus, 1758), синец Abramis ballerus (Linnaeus, 1758), уклейка Alburnus alburnus (Linnaeus, 1758), чехонь Pelecus cultratus (Linnaeus, 1758) и густера Blicca bjoerkna (Linnaeus, 1758) из Рыбинского водохранилища; серебряный карась Carassius auratus (Linnaeus, 1758) и сеголетки карпа Cyprinus carpió (Linnaeus, 1758) из экспериментальных прудов
Института биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН, р. Сунога. У всех рыб определяли стадию зрелости гонад по шкале, применяемой в ихтиологической и рыбоводной практике (Сакун, Буцкая, 1968).
Кровь отбирали сразу после отлова рыб из хвостовых кровеносных сосудов. Сыворотку получали, отстаивая кровь при 4°С; для получения плазмы кровь собирали в пробирки с 1% гепариноидом, осевшие эритроциты удаляли центрифугированием при 2000 об/мин.
Множественность НМ-фракции оценивали по числу белков, разделяемых по их электрофоретической подвижности Rf и расположению на электрофореграмме в диск-электрофорезе (диск-E) в 7.5% полиакриламидном геле (ПААГ) (Davis, 1964; Ornstein, 1964). Для анализа способа организации отдельных белков применяли неденатурирующий 2Б-элекгрофорез (2D-Е) в градиенте концентраций 5-40% ПААР в модификации метода Коппершландера с соавторами (Kopperschlander et al.,
1969) и денатурирующий электрофорез в 11% ПААГ с 8М мочевиной в модификации метода Крейтона (Creighton, 1979) и в 12.5% SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях (Laemmli,
1970). В первом направлении проводили диск-электрофорез в 7.5 или 4.9% ПААГ (Гааль и др., 1982).
Организацию белка по типу мономер/олигомер устанавливали, сопоставляя степень дифференцирования белка в разных системах 2D-E. Если белок в градиенте ПААГ и ПААГ с мочевиной был представлен одним "пятном", его считали мономером, если несколькими "пятнами" в ПААГ с мочевиной - олигомером, стабилизированным водородными связями. Если в ПААГ с мочевиной белок был представлен меньшим количеством "пятен", чем в SDS-ПААГ, считали, что в структуре полипептидной цепи присутствуют S-S-связи.
В качестве маркеров Мм использовали PageRulerPM Prestained Protein Ladder Plus (11, 17,28, 36,55,72, 95, 130,250 кДа) (Fermentas) и полимерные формы сывороточного альбумина человека HSA (67, 134, 201, 268 кДа), овальбумина OA (45, 90,135 кДа) и миоглобина Mb (17, 34, 68 кДа).
За связыванием альбуминоподобных белков с синим Эванса (Evans blue, Dudley, Германия) наблюдали в ходе электрофореза. В лунки геля вносили сыворотку, предварительно инкубированную с 0.01% водным раствором красителя (раствор Эванса). Смесь для внесения в лунку геля содержала 0.6-1.0 мкл раствора Эванса, 4 мкл 40% сахарозы и 2 мкл сыворотки; в контрольную лунку вносили краситель и сахарозу. После завершения электрофореза края окрашенной красителем полосы помечали небольшими сквозными проколами геля, затем белки в геле фиксировали 12% трихлоруксусной кислотой (РХУ) и окрашивали Кумасси
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.