ОНТОГЕНЕЗ, 2007, том 38, № 1, с. 44-51
^ ГЕНЕТИКА
РАЗВИТИЯ
УДК 575.16
ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ ГЕНОВ АСПАРТАТАМИНОТРАНСФЕРАЗЫ В РАННЕМ РАЗВИТИИ НЕКОТОРЫХ ВИДОВ КАРПОВЫХ РЫБ И ИХ МЕЖРОДОВЫХ ГИБРИДОВ F11
© 2007 г. А. М. Андреева
Институт биологии внутренних вод им. И.Д. Папанина РАН 152742 Борок, Ярославская область E-mail: aam@ibiw.yaroslavl.ru Поступила в редакцию 24.01.06 г.
Окончательный вариант получен 19.06.06 г.
Исследовали различные временные показатели проявления активности родительских аллелей гена аспартатаминотрансферазы Aat-1 в раннем развитии межродовых реципрокных гибридов F1 леща, плотвы и синца. Установлено, что в тех случаях, когда первое проявление Aat-1 приходилось на ранние стадии развития (поздняя бластула-гаструла), родительские аллели гена активировались асинхронно по материнскому типу (гибриды синец х плотва). В тех случаях, когда первое проявление гена Aat-1 приходилось на более поздние стадии (рассасывание желточного мешка), родительские аллели активировались синхронно (гибриды лещ х плотва, плотва х лещ, плотва х синец). Характер активации зародышевых генов определяется влиянием материнской среды, при этом не исключается влияние межаллельных взаимодействий: Aat-f/Aat-sl (лещ х плотва, плотва х лещ, плотва х синец) и Aat-sl/Aat-med (синец х плотва).
Ключевые слова: раннее развитие, карповые рыбы, гибриды, аспартатаминотрансфераза, материнские и отцовские аллели АМ-1.
Одним из аспектов изучения закономерностей функционирования генома в онтогенезе является исследование различных состояний родительских аллелей, а также способов их взаимодействия на самых ранних этапах развития (Корочкин, 1999). Наиболее подходящими объектами для успешной разработки данного направления являются отдаленные гибриды (Нейфах, Тимофеева, 1978; Ней-фах, Абрамова, 1979; Кирпичников, 1987).
Среди позвоночных отдаленная гибридизация в естественных условиях наиболее часто отмечается у рыб (Rubidge, Taylor, 2004; Volff, 2005), в частности в семействе карповых между лещом Abramis brama (L.) и плотвой Rutilus rutilus (L.) (Рябов, 1979; Wood, Jordan, 1987; Fahy et al., 1988; Ver-spoor, Hammar, 1991; Яковлев, Слынько, 1998; Слынько и др., 1999; Слынько, 2000; Яковлев и др., 2000), лещом и красноперкой Scardinius er-ithrophthalmus (L.) (Kopiejewska et al., 2004), золотым карасем Carassius carassius (L.) и интродуци-рованными в Великобритании некоторыми видами карповых (Cyprinus carpió (L.) и неидентифицированные виды Carassius spp.) (Hanfling et al., 2005), между тремя видами тропи-
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 03-04-48447).
ческих карповых (Simonsen et al., 2004), а также между видами из других семейств, например ко-люшковых (Takahashi et al., 2005).
В результате гибридизации создается новый генотип, совмещающий чужеродные геномы матери и отца. От их согласованности на самых ранних этапах развития зависит и судьба гибрида. При этом как для каждого гена, так и генома гибрида в целом возможен весь спектр различных состояний родительских аллелей, начиная от полной инактивации одного из них и кончая равной активностью обоих. Кроме того, в онтогенезе имеют место различные временны е показатели проявления активности отцовских и материнских аллелей генов: от раннего проявления генов (на стадиях бластулы-гаструлы) до более позднего (этап рассасывания желтка), от асинхронного (неодновременного) до синхронного(одновременного) (Глушанкова и др., 1973; Champion, Whitt, 1976; Neyfakh et al.,1976; Frankel, Hart, 1977; Pon-tier, Hart, 1978, 1979; Кирпичников, 1987; Корочкин, 1999; Слынько и др., 1999; Чадов, 2002; Андреева, 2005).
Несмотря на наличие большого массива данных по морфогенетическому и генетико-биохи-мическому анализу раннего развития гибридов
рыб, точно сказать, на каком этапе развития и каким образом достигается компромисс в работе чужеродных геномов, не представляется возможным, так как нет четких представлений о закономерностях согласования чужеродных генов и геномов и об эффектах наследования. Основная цель работы - определение времени (стадия развития) и характера (синхронный, асинхронный) проявления родительских аллелей гена Aat-1 внутриклеточной растворимой аспартатамино-трансферазы (ААТ) [К.Ф.2.6.1.1.] у межродовых реципрокных гибридов F1 карповых рыб леща Abramis brama (L.), синца Abramis ballerus (L.) и плотвы Rutilus rutilus (L.) в период раннего развития.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Половозрелых производителей отлавливали в период нереста в районе Волжского плеса Рыбинского водохранилища. Оплодотворение проводили сухим способом (Рябов, 1981) с использованием отработанной для данных видов технологии подготовки производителей, получения и выращивания гибридов F1 (Слынько, 2000). Потомство от внутривидовых и межродовых реципрокных скрещиваний (всего семь групп: лещ х лещ, плотва х плотва, синец х синец, плотва х лещ, лещ х х плотва, плотва х синец, синец х плотва) было получено в весенне-летние периоды 1999, 2000 и 2002 гг. (Слынько и др., 1999; Андреева и др., 2000; Лапушкина, 2002; Андреева, 2005).
Всего во внутривидовых скрещиваниях было задействовано пар производителей: плотвы и леща - четыре, синца - одна; в межродовых скрещиваниях: плотвы и леща - четыре, леща и плотвы -четыре, плотвы и синца - две, синца и плотвы -одна пара производителей.
Температуру воды, в которой инкубировали зародыши, поддерживали в пределах температурных оптимумов, °С: в 1999 г. - 15-19, в 2000 г. -18-19, в 2002 г. - 15.5-21 и 13.5-19. Диапазоны с верхней границей 19°С условно обозначали как "холодные", а с верхней границей 21°С - "теплые".
Гибриды F1 плотвы и синца, в природе не встречающиеся, использовали для верификации результатов, полученных на гибридах плотвы и леща.
Сравнительный анализ характера проявления родительских аллелей Aat-1 у "чистых" видов и гибридов F1 проводили по группам зародышей, инкубированных в "холодном" диапазоне.
Зародыши и личинки отбирали на следующих стадиях: 1) образования перивителлинового пространства и бластодиска, 2) бластулы, 3) окончания эпиболии, 4) трех сегментов, 5) разгара сегментации тела (18-23 сегментов), 6) окончания
сегментации и установления кровообращения (43-48 сегментов), 7) вылупления, 8) этапа смешанного питания, 9) этапа полного рассасывания желточного мешка и перехода на внешнее питание, 10) малька (Крыжановский, 1949, 1968; Игнатьева, 1987).
В общей сложности было проанализировано 1808 зародышей и личинок. Для контроля использовали неоплодотворенные яйцеклетки текучих самок и белые мышцы производителей. К индивидуальным икринкам (зародышам, личинкам, кусочкам белых мышц) добавляли фиксированный объем 20%-ной сахарозы, однократно надавливали стеклянной палочкой до разрыва яйцевых оболочек и далее замораживали их до окончания сбора проб. Началом сбора проб считали момент скрещивания, концом - достижение стадии экзогенного питания. Период сбора проб не превышал трех недель. Для проведения элек-трофоретического анализа все пробы одновременно размораживали и центрифугировали 20 мин при 18000 об/мин и температуре +4°С. Супернатант вносили в лунки блока полиакрил-амидного геля (ПААГ) в объеме 20 мкл и проводили диск-электрофорез (Davis, 1964; Omstein,
1964). Анализ контрольных образцов и проб зародышей и личинок проводили одновременно в блоке ПААГ (40 лунок) для получения сопоставимых изоферментных спектров. О смене оогене-тической ААТ ферментом, контролируемым генами Aat-1 зародыша гибрида, судили по появлению отцовского фермента в тех случаях, когда отцовский и материнский ферменты различались по электрофоретической подвижности. После электрофореза изоферментные спектры внутриклеточной растворимой ААТ выявляли с помощью специфического окрашивания (Бернстон,
1965).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Особенности проявления Äat-1 из мышц половозрелых леща, плотвы и синца. У исследуемых видов рыб описано три разных аллеля полиморфного локуса Aat-1 (Слынько, 1997, 2000). ААТ является ферментом, состоящим из двух субъединиц (Корочкин и др., 1977). В проводимых скрещиваниях родительские экземпляры синца были гомозиготами по медленному (slow) аллелю, обозначенному нами как Aat-sl, леща -гомозиготами по быстрому (fast) аллелю Aat-f. Соответствующие гомодимерные изоферменты мы обозначили как ААТ-sl и ААТ-f. У плотвы был выявлен аллель Äat-med, продукт которого занимал на электрофореграмме промежуточное (media) положение между изозимами ААТ-f и ААТ-sl. Родительские экземпляры плотвы, участвующие в скрещиваниях, были представлены в двух вариантах: гомозиготами по медленно-
+ 1 2 3 4 1 2 3 4
Рис. 1. Изоферментные электрофоретические спектры аспартатаминотрансферазы (ААТ) (а) из белых мышц плотвы (1, 2), синца (3) и леща (4) и их схематичное изображение (•). Здесь и на рис. 3: вертикальная стрелка от катода (-) к аноду (+) обозначает направление диск-электрофореза. Обозначения гомодимеров ААТ^1, ААТТ, ААТ-med и т.д. см в тексте.
му аллелю Aаt-sl и гетерозиготами по Aat-sl/med. Гетерозиготный экземпляр плотвы использовали только в межродовом скрещивании синец х плотва (рис. 1, 2).
Время проявления Аа^1 в потомстве от внутривидовых скрещиваний. При всех температурах инкубации активность ААТ у "чистых" лещей на стадиях от оплодотворения до окончания сегментации не выявлена, что связано, вероятно, с ее относительно низким уровнем на данном этапе онтогенеза. Слабо выраженные гомодимеры ААТ^ у леща были обнаружены только на стадии вылупления, четко выраженные - на стадии смешанного питания (рис. 2, а).
У плотвы выявлена следовая активность ААТ в неоплодотворенных икринках текучих самок и в зародышах на самых ранних стадиях развития. Во всех группах "холодной" линии появление выраженных полос активности ААТ на электрофоре-граммах приходилось на стадию разгара сегментации (рис. 2, а).
В зародышах плотвы из "теплой" группы выраженные полосы гомодимеров ААТ-в1 были обнаружены на стадии трех сегментов.
У зародышей синца, в отличие от леща и плотвы, выраженные полосы гомодимеров ААТ-в1 обнаруживались значительно раньше - на стадии гаструлы (рис. 2, а).
Время
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.