БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 5, с. 421-429
УДК 577352
ОСОБЕННОСТИ РАЗОБЩАЮЩЕГО ДЕЙСТВИЯ ЖИРНЫХ КИСЛОТ В МИТОХОНДРИЯХ ПЕЧЕНИ ПРИ ОКИСЛИТЕЛЬНОМ СТРЕССЕ
© 2007 г. О. В. Кожина, Л. А. Степанова, В. Н. Самарцев
Марийский государственный университет, 421001 Йошкар-Ола, пл. Ленина, 1; факс:(836-2)45-45-81; электронная почта: samvic@pochta.ru Поступила в редакцию 15.11.2006 г.
После доработки 25.01.2007 г.
Рассмотрено влияние окислительного стресса на протонофорное разобщающее действие пальмитата в митохондриях печени при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. Показано, что в контролируемом состоянии в митохондриях накапливаются диеновые конъюгаты. Этот процесс подавляется тролоксом, тиомочевиной, пируватом, ^этилмалеимидом, а также пальмитатом. Под влиянием трет-бутилгидропероксида продукция диеновых конъюгатов усиливается, что рассматривается как активация свободнорадикальных реакций. Инкубация митохондрий с трет-бутилгидроперок-сидом или с ^этилмалеимидом не влияет на скорость дыхания в отсутствие или в присутствии пальмитата, но устраняет способность аспартата и карбоксиатрактилата подавлять разобщающее действие пальмитата. Такое действие трет-бутилгидропероксида не наблюдается в присутствии тро-локса, тиомочевины или пирувата, в то время как эффект ^этилмалеимида устраняется только тиомочевиной или меркаптоэтанолом. Предполагается, что под влиянием окислительного стресса, вызванного трет-бутилгидропероксидом, или вследствие алкилирующего действия ^этилмалеимида в митохондриях печени при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров формируется разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот. Этот процесс связан с окислением или алки-лированием критических SH-групп, возможно, принадлежащих этим переносчикам.
Митохондрии являются основным источником активных форм кислорода, образующихся в клетке [1, 2]. В процессе одноэлектронного восстановления кислорода в комплексах I и III дыхательной цепи образуется супероксидный анион-радикал, из которого в результате как ферментативных, так и неферментативных реакций могут образоваться пероксид водорода, гидроксильный радикал и другие активные формы кислорода [1-4]. Продукция активных форм кислорода в митохондриях существенно усиливается при старении животных, что может быть одной из причин деструктивных изменений в клетках [1, 5].
Образование активных форм кислорода в митохондриях можно замедлить путем индукции протонной проводимости внутренней мембраны жирными кислотами (мягкое разобщение) [6, 7]. В связи с этим большой интерес представляет изучение механизмов и путей регуляции разобщающего действия жирных кислот. В митохондриях печени в отсутствие ионов кальция протонофорное разобщающее действие жирных кислот осуществляется при участии белков-переносчиков внутренней мембраны: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров [7-10]. В этом случае ингибитор ADP/ATP-ан-типортера карбоксиатрактилат и субстраты аспар-тат/глутаматного антипортера аспартат и глутамат подавляют разобщающее действие жирных кис-
лот или, говоря другими словами, обладают ресо-прягающим действием [9, 10].
Митохондриальные структуры чрезвычайно чувствительны к окислительному стрессу, вызванному активными формами кислорода, которые образуются в дыхательной цепи или под действием различных окислителей. Окислительный стресс сопровождается перекисным окислением липидов, возникновением мутаций в ДНК и окислением белков [1, 2]. При моделировании окислительного стресса в митохондриях широко применяются гидроперекиси органических соединений, например трет-бутилгидропероксид [11-13]. В предварительных исследованиях мы показали, что этот ок-сидант, не влияя на скорость дыхания митохондрий в отсутствие и в присутствии пальмитата, устраняет способность карбоксиатрактилата или аспартата подавлять разобщающее действие пальмитата, если их добавить после этой жирной кислоты [14]. Сходные изменения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата наблюдаются в митохондриях печени стареющих животных [15]. На основании этих результатов мы предположили, что при окислительном стрессе, вызванном трет-бутилгидропероксидом или процессами, происходящими при старении животных, ЛБР/ЛТР- и аспар-тат/глутаматный антипортеры формируют разобщающий комплекс с общим пулом жирных кислот [14, 15]. В этом случае жирные кислоты приобре-
тают способность перемещаться под влиянием ас-партата от аспартат/глутаматного антипортера к АБР/АТР-антипортеру и под влиянием карбокси-атрактилата - в противоположном направлении [14, 15]. Необходимо отметить, что действие трет-бутилгидропероксида на митохондрии многообразно. В отсутствие ионов кальция этот оксидант вызывает окисление пиридиновых нуклеотидов и глутатиона [11, 13, 16, 17] и образование метильно-го и других свободных радикалов [18]. В этих условиях окисление глутатиона в митохондриях сопровождается повышением уровня гидропероксидов [19] и диеновых конъюгатов [13, 20]. Предполагается, что модификация разобщающего действия жирных кислот трет-бутилгидропероксидом при участии АБР/АТР- и аспартат/глутаматного анти-портеров может быть вызвана продуктами пере-кисного окисления липидов или окислением критических SH-групп [14, 15]. Однако механизмы регуляции протонофорного разобщающего действия жирных кислот при окислительном стрессе недостаточно изучены. Значительный интерес представляет влияние ингибиторов свободнорадикаль-ных реакций на протонофорное разобщающее действие жирных кислот. Среди антиоксидантов наше внимание привлекли "уборщики" свободных радикалов: водно-растворимый аналог а-токофе-рола тролокс [21] и тиомочевина [22]. Среди соединений, способных модифицировать SH-группы, вызывает интерес алкилирующий агент ^этилма-леимид, способный проходить через внутреннюю мембрану митохондрий и взаимодействовать с SH-группами в гидрофобной области мембраны [23].
В настоящей работе изучено влияние окислительного стресса на протонофорное разобщающее действие жирных кислот при участии АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени. В качестве индуктора окислительного стресса использовали трет-бутилгидропероксид в отсутствие и в присутствии антиоксидантов. Особое внимание было уделено роли критических SH-групп митохондрий в реализации способности ас-партата и карбоксиатрактилата подавлять разобщающее действие жирных кислот. Изменения разобщающего действия жирных кислот рассматриваются как один из механизмов антиоксидантной защиты в митохондриях печени.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Митохондрии выделяли из печени общепринятым методом дифференциального центрифугирования с последующим освобождением от эндогенных жирных кислот с помощью свободного от жирных кислот бычьего сывороточного альбумина, как подробно описано ранее [10]. Концентрацию белка митохондрий определяли биуретовым методом, в качестве стандарта использовали бычий сывороточный альбумин. Дыхание митохон-
дрий регистрировали при температуре 25°С с помощью кислородного электрода Кларка и поляро-графа LP-9. Концентрация белка митохондрий в кислородной ячейке ~1.2 мг/мл. Среда инкубации содержала 200 мМ сахарозу, 20 мМ KCl, 5 мМ сук-цинат калия, 2 мМ MgCl2, 0.5 мМ EGTA, 5 мМ MOPS-трис (рН 7.0 или 7.4). Олигомицин (2 мкг/мл) и 2 мкМ ротенон добавляли в кислородную ячейку сразу после митохондрий. При определении скорости дыхания в процессе окислительного синтеза ATP (состояние 3) среда инкубации дополнительно содержала 5 мМ KH2PO4 без олигомицина. В этом случае через 2 мин после ротенона к митохондриям добавляли 200 мкМ ADP. Величину коэффициента ADP/O определяли пульсовым методом [24].
Ресопрягающие эффекты карбоксиатрактилата и аспартата выражали в процентах и определяли как отношение величины ингибирования дыхания в присутствии пальмитата одним из этих ресопрягаю-щих агентов к величине стимуляции дыхания паль-митатом по формуле 100АJJ(Ju - J0), где Ju и J0 - скорость дыхания соответственно в присутствии и в отсутствие пальмитата; ÄJu - величина снижения скорости дыхания ресопрягающим агентом.
Содержание диеновых конъюгатов в митохондриях определяли после экстракции гептаном спектрофотометрическим методом [25]. Митохондрии (1.4 мг белка на мл) суспендировали в среде инкубации при перемешивании при 25°С. Увеличение содержания диеновых конъюгатов в митохондриях (фактор а) выражали в относительных единицах и определяли по формуле: а = (AA -- AA0)/AA0, где AA0 и ÄA - оптическая плотность гептанового экстракта при 233 нм в начальный момент времени инкубации митохондрий и через 5 мин соответственно. Среднее значение AA0 составляло 0.073 ± 0.003 ед. оптической плотности на 1 мг белка (n = 9).
В работе использовали MOPS, трис, пальмитиновую кислоту, олигомицин, сукцинат калия, ас-партат калия, N-этилмалеимид, пируват натрия, карбоксиатрактилат, очищенный от жирных кислот бычий сывороточный альбумин ("Sigma", США), ротенон, ADP, EGTA ("Serva", Германия), 2,4-динитрофенол, трет-бутилгидропероксид, сахарозу ("Fluka" Германия), тролокс ("Aldrich", Германия) KCl, MgCl2 ("Merck", Германия). Остальные реактивы квалификации х.ч. и ос.ч. произведены в России. Использовали растворы пальмитиновой кислоты (10 и 20 мМ) в дважды перегнанном этаноле.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В контролируемом состоянии (в отсутствие ADP или разобщителей) дыхательная цепь митохондрий продуцирует активные формы кислорода [6, 7]. В наших опытах (табл. 1) инкубация мито-
хондрий в контролируемом состоянии в присутствии сукцината, ротенона и олигомицина сопровождается накоплением диеновых конъюгатов. Образование диеновых конъюгатов рассматривается как свидетельство усиления свободнорадикальных реакций, инициирующих перекисное окисление ли-пидов [25, 26]. Уборщики свободных радикалов тро-локс и тиомочевина замедляют накопление диеновых конъюгатов в контролируемом состоянии (табл. 1). Подавление образования диеновых конъюгатов наблюдается также при инкубации митохондрий в присутствии пальмитата (табл. 1), что согласуется со способностью жирных кислот препятствовать образованию активных форм кислорода в митохондри
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.