ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 6, с. 406-411
= БИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 633.52-575.113:577.21
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ И РЕПРОДУКЦИИ ТРАНСГЕННЫХ
РАСТЕНИЙ ЛЬНА-ДОЛГУНЦА
© 2014 г. В. А. Лемеш*, Т. Е. Саматадзе**, Е. В. Гузенко*, Е. В. Железнякова*, А. В. Амосова**, А. В. Зеленин**, О. В. Муравенко**
*Институт генетики и цитологии НАНБеларуси Республика Беларусь, 220072, Минск, ул. Академическая, 27 **Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН Российская Федерация, Москва, ул. Вавилова, 32 E-mail: olgmur1@yandex.ru Поступила в редакцию 14.01.2014 г.
Окончательный вариант получен 03.02.2014 г.
С использованием биобаллистической трансформации гипокотильных эксплантов льна-долгунца сорта Василек получены первичные трансформанты, несущие генетическую конструкцию с химерным геном gfp-tua6. Жизнеспособные модифицированные растения послужили основой для создания самоопыленных линий, у которых подтверждено наследование введенной генетической конструкции при воспроизведении в течение трех генераций. У трансгенных растений изучены особенности фенологических стадий роста, высота растений, число коробочек и мейоз. Сравнение трансформированных линий по годам воспроизводства выявило значительное снижение образования семян у одной из них. Это послужило причиной проведения анализа мейоза этих линий на стадиях метафазы I и анафазы I. Показано, что процент клеток с нарушениями мейоза был самым высоким у трансгенных растений из линии с самой низкой семенной продуктивностью. Таким образом, неспецифическое встраивание генетической конструкции с использованием биобаллистической трансформации в геном трансформантов льна-долгунца в разной степени нарушают течение мейоза, что и является основной причиной неодинаковой воспроизводимости трансгенных линий льна-долгунца. Можно заключить, что для получения стабильно воспроизводящихся линий трасгенных растений целесообразно проводить у них систематический анализ мейоза.
Ключевые слова: лен-долгунец, биобаллистическая трансформация, трансгенные линии, фенологические и морфологические признаки, мейоз.
DOI: 10.7868/S0475145014060081
ВВЕДЕНИЕ
Известно, что интеграция трансгенов в геном растений отражается на их онтогенетическом развитии и вызывает изменения различных морфологических признаков: формы листовых пластинок и строения цветков (Van Lijsebettens et al., 1991; Uchimiya et al., 1995; Ohshima et al., 1997); высоты растений (Feldman et al., 1989). В зависимости от места встройки ДНК-инсерции могут стать причиной эмбриолетальности (Errampalli etal., 1991), мужской стерильности (Peirson et al., 1997), а также приводить к хромосомным аберрациям (Choi et al., 2000). Вместе с тем, в настоящее время значительно расширяется применение методов генной инженерии при выведении новых сортов хозяйственно-ценных растений, что позволяет быстро получить новый признак, недостижимый для данного организма путем традиционной селекции. Этот подход особенно важен для
получения новых сортов льна-долгунца, поскольку высокая генетическая однородность существующих его сортов и отсутствие близкородственных доноров необходимых хозяйственно-ценных признаков в значительной мере ограничивает возможности традиционной селекционной работы.
Лен посевной (Linum usitatissimum L., 2n = 30) — одна из древних технических культур комплексного использования, значение которой в мире неизменно высоко. Его разновидность лен-долгунец или прядильный лен (elongate) возделывают для получения волокна. Другие разновидности: лен-кудряш (brevimulticaulia) и крупносемянный лен (macrospermum), объединяют под общим названием лен масличный, и выращивают для получения масла. Лен был в числе первых растений — объектов генной инженерии. На сегодняшний день нет данных о регистрации сортов, созданных на основе генетически модифицированных ли-
ний льна-долгунца, и их коммерческом использовании. Проводятся лабораторные исследования по использованию агробактериальной и ПЭГ-индуцированной трансформации для создания модифицированных растений льна-долгунца (Чикризова, 1997; Millam et al., 2005; Wro-bel-Kwiatkowska et al., 2007; Каляева, 2001). Получение стабильно воспроизводимых трансгенных линий льна-долгунца до сих пор остается трудно решаемой задачей, что делает особенно актуальным дальнейшее изучение особенностей развития и репродукции генетически модифицированных линий этого растения.
В данной работе в результате биобаллистической трансформации гипокотильных эксплантов льна-долгунца сорта Василек получены трансгенные самоопыленные линии и проведен анализ особенностей их развития и воспроизведения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве исходного материала использован позднеспелый сорт льна-долгунца Василек белорусской селекции (Ловчая, 2009).
Для биобаллистической трансформации использовали сегменты гипокотилей пятидневных проростков длиной 5—7 мм. Биобаллистическую трансформацию гипокотильных эксплантов проводили по ранее описанной методике (Гузенко, Лемеш. 2013). Вводимая конструкция содержала химерный ген gfp-tua6 (слитая рамка считывания) под контролем 35S промотора вируса мозаики цветной капусты (СаМУ), в качестве селективного маркерного гена конструкция включала nptII ген, который обеспечивает устойчивость к кана-мицину (Ueda et al., 1999). Достоверность результатов, свидетельствующих об экспрессии целевого гена GFP-меченного тубулина в геноме растений-трансформантов, подтверждалась методом конфокальной микроскопии (наличие специфического зеленого свечения флюоресцентного белка GFP); достоверность встройки последовательности селективного маркерного гена nptII и 35S промотора подтверждалась методом ПЦР-анализа (Лемеш и др., 2010).
Жизнеспособные предположительно трансгенные побеги проходили укоренение in vitro по методике, разработанной нами для укоренения растений-регенерантов льна-долгунца и льна-масличного (Гузенко и др., 2009).
Для изучения мейоза использовали молодые бутоны. Приготовление препаратов, окрашивание хромосом и анализ мейоза проводили по описанной ранее методике (Саматадзе и др., 2012). Для характеристики отдельных фаз мейотическо-го деления использовали не менее 5 препаратов и анализировали не менее 70 клеток. Для каждой
Рис. 1. Флюоресценция белка GFP в результате экспрессии химерного гена ^р-Шаб в клетках побега льна-долгунца, сформировавшегося на каллусе после проведения биобаллистической трансформации (черные вкрапления).
стадии подсчитывали процент клеток с нормальным прохождением мейоза и с нарушениями.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
С применением биобалистической трансформации гипокотильных эксплантов льна-долгунца сорта Василек получены трансгенные растения, несущие генетическую конструкцию с химерным геном ^р-Шаб. Метод биобаллистики (прямой трансформации) считается одним из перспективных способов введения чужеродной ДНК (Wijayanto, 1998; Wijayanto е! а1., 1999). Он пригоден для трансформации любых растительных объектов, тканей и органов; не нуждается в сложных векторных конструкциях; возможна прямая регенерация трансгенных побегов минуя каллус; возможно введение нескольких генов одновременно. Трансгенный статус первичных трансформантов подтвержден с использованием конфокальной микроскопии (наличие специфического зеленого свечения флюоресцентного белка GFP) (рис. 1). Методом ПЦР-анализа доказана достоверность встройки последовательности 35$ промотора и селективного маркерного гена прШ.
По результатам молекулярно-генетического анализа было отобрано 24 первичных трансформанта, несущие полноценную генетическую конструкцию с химерным геном ^р-Шаб. Наблюдения за онтогенезом трансгенных растений показали, что фенологические стадии роста (елочка, быстрый рост) были намного продолжительней, чем у исходного сорта Василек. В фазе "елочки" обычно растение льна-долгунца достигает высоты 5—10 см и имеет несколько (5—6) пар густо рас-
Характеристика по основным морфологическим признакам модифицированных самоопыленных линий, полученных на основе сорта Василек
Образец Василек У-2 У-3
Год репродукции 2011 2012 2011 2012 2011 2012
Высота растения, см Количество коробочек, шт. Количество семян в коробочке, шт. 113.7 ± 3.2 27.2 ± 2.9 7.0 ± 0.4 118.8 ± 1.9 15.7 ± 0.4 8.1 ± 0.4 105.6 ± 1.5 11.0 ± 1.1 3.8 ± 0.2 103.4 ± 1.2 10.3 ± 0.7 3.0 ± 0.4 107.1 ± 1.3 9.4 ± 0.9 3.9 ± 0.3 105.6 ± 0.5 10.4 ± 0.7 1.2 ± 0.3
положенных настоящих листочков, продолжительность данной фазы составляет примерно 15 дней. Продолжительность периода быстрого роста в зависимости от сорта льна составляет 12— 20 дней, после которой следует бутонизация и цветение (Ловчая, 2009). Полученные в наших экспериментах первичные трансформанты фазу "елочки" проходили около 30 дней, продолжительность периода бурного роста составила от 30 до 60 дней, что в 2—3 раза превышало обычные сроки. При этом фаза бутонизации и цветения наступила у части растений, а семена завязали только некоторые из них.
Лучшими жизнеспособными трансгенными формами оказались два растения, которые послужили основой линий У-2 и У-3. Известно, что для отбора стабильных трансформантов необходим контроль и анализ растений в течение трех и более поколений, поэтому полученные нами линии воспроизводились в течение трех генераций. В каждом поколении линий У-2 и У-3 проводился отбор истинных растений-трансформантов с помощью ПЦР-скрининга, что позволило установить достаточно стабильное наследование генетической конструкции с химерным геном &р-Шаб. По годам воспроизводства трансгенные растения обеих линий по продолжительности фенологических стадий роста практически не отличались друг от друга и от контрольных растений сорта Василек. Это свидетельствует в пользу стабилизации функционирования генома в целом у потомков первичных трансформантов уже в следующем поколении.
В таблице приведена характеристика самоопыленных линий У-2, У-3, полученных на основе трансгенных растений, по основным морфологическим признакам за два года репродукции в условиях теплицы. Из таблицы следует, что у трансформантов льна-долгунца по сравнению с исходным не наблюдалось существенного изменения высоты растений, то
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.