РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2012, том 6(15), № 2, с. 155-161
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ АПОПТОЗА В ЭНДОМЕТРИИ ПАЦИЕНТОК С ТРУБНО-ПЕРИТОНЕАЛЬНЫМ БЕСПЛОДИЕМ, УЧАСТВУЮЩИХ В ПРОГРАММЕ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОГО ОПЛОДОТВОРЕНИЯ (ЭКО)
© 2012 г. Ю.С. Анциферова, И.К. Богатова, А.В. Бойцова
ФГБУ «Ивановский научно-исследовательский институт материнства и детства имени В.Н. Городкова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской
Федерации, Иваново, Россия
Поступила: 03.02.2012. Принята: 11.05.2012
Целью работы было оценить характер регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитонеальным бесплодием, а также выявить взаимосвязь между параметрами апоптоза и успехом наступления беременности у этих женщин после проведения ЭКО. Проведено обследование 63 женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, которые в дальнейшем участвовали в программе ЭКО. 13 здоровых фертильных женщин составили контрольную группу. Материалом для исследования служили биоптаты эндометрия, полученные в период «окна имплантации» менструального цикла, предшествующего овариаль-ной стимуляции. Уровень экспрессии мРНК факторов, регулирующих апоптоз (XIAP, PTEN, каспаза-3, HSP27) и IFNy в ткани эндометрия оценивали методом RT-PCR в режиме реального времени. Установлено, что в эндометрии пациенток с бесплодием, обусловленным труб-но-перитонеальным фактором, повышен уровень экспрессии мРНК антиапоптотических факторов XIAP и HSP27 при одновременном усилении экспрессии мРНК фактора PTEN, обладающего проапоптотическим действием. Наступление беременности после проведения ЭКО отмечалось у женщин с максимально высокими значениями уровня экспрессии в ткани эндометрия мРНК PTEN и IFNy. IFNy в концентрации 50 пг/мл in vitro оказывал стимулирующее влияние на экспрессию в эндометрии мРНК PTEN. По-видимому, при труб-но-перитонеальном бесплодии одним из маркеров готовности эндометрия к имплантации является уровень синтеза в ткани PTEN. Регуляция выработки этого фактора в эндометрии находится под контролем IFNy.
Ключевые слова: апоптоз, ЭКО, трубно-перитонеальное бесплодие
ВВЕДЕНИЕ
Апоптоз, по мнению многих исследователей, является ключевым процессом, способствующим ремоделированию ткани эндометрия [1]. Как известно, в норме эндометрий подвергается циклическим изменениям, соответствующим 3 фазам менструального цикла — пролиферативной, секреторной и менструальной. При этом элиминация стареющих клеток из функционального слоя эндометрия в конце секреторной фазы и в течение менструации сопровождается усилением апоптоза, тогда как нарастание клеточной массы базального слоя эндометрия в течение
Адрес: 153009, Иваново, ул. Мякишева, д. 5., кв. 24. E-mail: niimid.immune@mail.ru
пролиферативной фазы происходит на фоне угнетения апоптоза [2]. Регуляция апоптоза в эндометрии определяется преимущественно соотношением синтезируемых в ткани про- и антиапоптотических факторов [2].
Показано, что процесс подготовки эндометрия к имплантации эмбриона связан с особым характером регуляции апоптоза эн-дометриальных клеток. Так, начальные этапы имплантации эмбриона сопровождаются регрессией клеток эндометрия за счет усиления активности каспазы-3, что позволяет трофо-бласту инвазировать в материнскую часть формирующейся плаценты [3]. При децидуа-лизации эндометрия усиливается апоптоз как эпителиальных, так и стромальных эндомет-риальных клеток, что обусловлено повышенной экспрессией в ткани генов проапоптоти-ческих факторов р53 и Ьах [4]. Есть данные,
что в эндометрии женщин с бесплодием неясного генеза снижено количество апоптирую-щих клеток, угнетена экспрессия белка р53 и усилена продукция Вс1-2, что, по мнению исследователей, может приводить к дефекту имплантации у этих пациенток [5]. Факторы, контролирующие апоптоз в эндометрии, до конца не установлены, однако имеющиеся литературные данные указывают на важную роль цитокинов в этом процессе [6]. Известно, что 1РЫу непосредственно вовлекается в регуляцию клеточного ремоделирования, пролиферации и миграции в эндометрии в процессе его подготовки к имплантации и на начальных этапах беременности [7]. В ряде работ была продемонстрирована важная роль этого цитокина в регуляции апоптоза. Установлено, что 1РЫу оказывает прямое апо-птоз-индуцирующее действие, которое реализуется за счет стимуляции таких проапоп-тотических факторов, как каспаза-3, -12 и А1Р (апоптоз-активирующий фактор) [8]. Однако влияние 1РЫу на апоптоз клеток эндометрия в период подготовки его к имплантации остается практически не изученным.
В последние годы существенно возрос интерес исследователей к поиску маркеров, позволяющих оценить готовность эндометрия к имплантации. Это связано с широким распространением вспомогательных репродуктивных технологий, в том числе метода экстракорпорального оплодотворения (ЭКО). Во многих случаях ЭКО является единственным способом преодоления бесплодия, например, при трубно-перитонеальном факторе. Однако эффективность ЭКО остается пока еще относительно невысокой — 30 — 35% [9]. Многие исследователи считают, что нарушения на уровне эндометрия во многом определяют неуспех имплантации эмбриона при проведении ЭКО [10]. Поэтому уточнение факторов, влияющих на рецептивность и имплантаци-онный потенциал эндометрия и позволяющих прогнозировать успех программы ЭКО у женщин с бесплодием, представляет несомненный практический интерес.
В связи с этим целью нашего исследования было оценить характер регуляции апоптоза в эндометрии пациенток с трубно-перитоне-альным бесплодием, а также выявить взаимосвязь между особенностями экспрессии в ткани эндометрия мРНК факторов, обладающих про- и антиапоптотическим действием, и успехом наступления беременности у этих женщин после проведения ЭКО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Нами было обследовано 63 женщины с бесплодием, обусловленным трубно-пери-тонеальным фактором (основная группа). Все пациентки планировали в дальнейшем участвовать в программе ЭКО. 13 здоровых фертильных женщин составили контрольную группу. После проведения ЭКО наступление беременности было отмечено у 26 женщин основной группы, тогда как у 37 пациенток с бесплодием проведение ЭКО оказалось неэффективным. Таким образом, эффективность ЭКО на перенос составила 41,9%.
Материалом для исследования служили биоптаты ткани эндометрия, полученные в период «окна имплантации» менструального цикла, предшествующего овариальной стимуляции. Взятие образцов производилось методом пайпель-биопсии, что существенно снижало травматичность процедуры. Исследования были одобрены локальным этическим комитетом ФГБУ «Ив НИИ МиД им.В.Н.Город-кова» Минздравсоцразвития России и проводились с информированного согласия пациенток.
Проведение ПЦР-исследований
Образцы эндометриальной ткани лизи-ровали в растворе, содержащем гуанидин тиоцианат, цитрат натрия, саркозил и 2-мер-каптоэтанол. Из ткани эндометрия выделяли тотальную РНК стандартным феноловым методом. Полученную РНК переводили в комплементарную кДНК, используя рендом-гек-самеры и обратную транскриптазу (Promega, USA). Реакцию обратной транскрипции проводили при 70 °C в течение 3 мин. 37 °C в течение 60 мин и 98 °С в течение 3 мин.
Уровень экспрессии в эндометрии мРНК XAIP (X-связанного ингибитора апоптоза), PTEN (фосфатазы и тензин гомолога, делети-рованного на хромосоме 10), каспазы-3, белка теплового шока HSP27 и IFNy (интерферона у) оценивали методом количественной RT-PCR в режиме реального времени. В качестве гена домашнего хозяйства использовали уровень экспрессии мРНК ß2-микроглобулина. Прай-меры и зонды были синтезированы в ЗАО «Синтол» (Москва, Россия). Для количественного определения экспрессии генов в исследуемых образцах строили калибровочные кривые для ß2-микроглобулина и для изучаемых специфических генов с использованием серии десятикратных разведений образцов
контрольной кДНК. В каждом образце определяли количество копий нуклеотидов с использованием стандартной кривой, построенной при помощи программного обеспечения iCycler iQ (BioRad, USA). Количество копий специфических генов делили на количество копий гена домашнего хозяйства в каждом индивидуальном образце для получения нормализованных значений количества изучаемых генов [11]. Результаты представлены как нормализованное количество копий в образце х 10!/мкл для PTEN, нормализованное количество копий в образце х 102/мкл для кас-пазы-3, нормализованное количество копий в образце х 104/мкл для XIAP и HSP27 и нормализованное количество копий в образце х 106 / мкл для IFNy.
Определение влияния IFNy на регуляцию апоптоза в эндометрии
Для уточнения возможного влияния IFNy на синтез в ткани эндометрия генов, регулирующих апоптоз, биоптаты эндометрия механически измельчали на фрагменты величиной 2 — 5 мм3 и культивировали в среде RPMI 1640, содержащей IFNy (производства ООО «Цито-
кин», Санкт-Петербург) в концентрации 10 пг/мл и 50 пг/мл в течение 24 часов при 37 °С и 5% СО2. В качестве контрольных образцов использовались показатели эндометрия, культивировавшегося в тех же условиях, только в среде ИРМ1 1640. После окончания срока культивирования образцы ткани эндометрия лизировали для выделения РНК, и в них оценивали уровень экспрессии мРНК Х1АР, РТЕЫ, каспазы-3 и ШР27 методом ИТ-РСИ.
Статистический анализ
Статистическую обработку данных проводили с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий между изучаемыми группами определяли по ^критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Анализ данных, полученных при изучении характера регуляции апоптоза в ткани эндометрия женщин с трубно-перитонеальным бесплодием, показал, что у пациенток этой группы уровень экспрессии мРНК антиапоп-тотических факторов Х1АР и НБР27 был достоверно повышен по сравнению с показате-
Таблица 1. Особенности экспрессии в эндометрии женщин с трубно-перитонеальным бесплодием мРНК генов, регулирующих апоптоз, в зависимости от успеха наступления беременности после
проведения программы ЭКО
Показатель Контрольная группа (n = 13) Женщины с бесплодием (n = 63) Наступление беременности после ЭКО (n = 26) Отсу
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.