МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 1, с. 89-93
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 631.46:579.873.017.64
ОСОБЕННОСТИ РОСТА И МОРФОЛОГИЧЕСКОЙ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ АЦИДОФИЛЬНЫХ И НЕЙТРОФИЛЬНЫХ ПОЧВЕННЫХ СТРЕПТОМИЦЕТОВ
© 2004 г. Ю. В. Закалюкина, Г. М. Зенова, Д. Г. Звягинцев
Факультет почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова
Поступила в редакцию 03.12.02 г.
Показано, что ацидофильные актиномицеты обладают особым механизмом адаптации к условиям пониженного рН, которая проявляется в их способности расти на подкисленной среде быстрее, чем на нейтральной, изменять значение рН питательной среды до уровня, благоприятного для образования воздушного мицелия и спор. Нейтрофильные актиномицеты на питательной среде со значением рН ниже 5 либо не способны расти, либо растут значительно слабее, чем на нейтральной, не подщелачивают среду и не образуют воздушный мицелий.
Ключевые слова: стрептомицеты, ацидофильные почвенные актиномицеты, радиальная скорость роста.
Термин "ацидофильные" и "ацидотолерантные" актиномицеты появились в литературе относительно недавно, в 1970-х годах [1, 2]. До этого считалось, что все актиномицеты являются нейтрофилами. До сих пор остаются мало изученными биологические и эколого-функциональные особенности ацидофильных актиномицетов и их место в комплексе почвенных микроорганизмов.
При изучении комплексов актиномицетов, выделяемых из различных почв на подкисленную (значения рН 4.5 и 5.3) и нейтральную (рН 7.0) питательных средах было установлено, что в кислых и слабо кислых почвах численность ацидофильных актиномицетов выше численности ней-трофильных [3, 4]. Собрана коллекция культур ацидофильных и нейтрофильных стрептомице-тов.
Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение радиальной скорости роста и особенностей морфологической дифференцировки стреп-томицетов, выделенных из почв на подкисленных и нейтральных средах.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили 20 штаммов стрептомицетов, выделенных из почв различных типов при использовании нейтральной (рН 7.0) и подкисленной (рН 4.5 и 5.3) питательной среды Гаузе 1 (табл. 1). Для подкисления среды выделения применяли фосфатную буферную смесь, которую готовили из двух растворов 1/15 М №2НР04 и 1/15 М КН2Р04 в определенных соотношениях [5]. При подготовке питательной среды со значениями рН от 4 до 5 раздельно стерилизовали агар и
буферный раствор с ингредиентами среды Гаузе 1 [6]. Видовая идентификация проведена по Определителю актиномицетов [7].
Вследствие того, что динамика колониального роста стрептомицетов подчиняется линейному закону [8] считали возможным использовать показатели радиальной скорости роста стрептомицетов в качестве критерия для оценки роста культур. Радиальную скорость роста культур определяли, измеряя диаметр видимой колонии дважды: на 3-5-е сут (в момент появления колонии на питательном агаре в чашке Петри) и на 6-8-е сут (после заметного простым глазом изменения). Диаметр колонии измеряли 2-игловым циркулем во взаимоперпендикулярных направлениях с точностью до десятых долей миллиметра. Применяли агаризованную среду Гаузе 1 со спектром значений рН от 3.0 до 8.0. Для подкисления питательной среды в этих случаях использовали фосфатно-цитратную буферную смесь, состоящую из двух растворов 0.2 М Na2PO4 и 0.1 М раствор лимонной кислоты в определенных соотношениях [5]. Посев культур стрептомицетов проводили уколом в агаризованную среду. Опыт ставили в десятикратной повторности. Инкубацию вели при 28°C. Расчет показателей радиальной скорости роста осуществляли по формуле:
Kr =
d 2 - d! t, - tl '
где и ё2 - диаметр колонии (мм) соответственно в начальный и конечный момент измерения, и хг -время (сут) начального и конечного измерений.
Таблица 1. Характеристика объектов исследования
Вид стрептомицета рН среды выделения Почва, из которой данный штамм выделен
Streptomyces narbonensis (С2)х 4.5 Аллювиальная луговая
S. paШdovюlaceж (С3) 4.5 »
S. xanthocidicus (С7) 4.5 »
S. viridobrunneus (А5) 4.5 »
S. achromogenes (А6) 4.5 »
S. iverini (А7) 4.5 »
S. flavogriseus (А10) 4.5 »
S. thermoviolaceus (С5) 5.3 »
S. roseofulvus (С6) 5.3 »
S. xanthocidicus (А2) 5.3 »
S. viridobrunneus (11) 5.3 Низинная торфяная
S. viridogenes (Е) 5.3 Дерново-подзолистая
S. fumosus (О) 5.3 Дерново-подзолистая
S. argenteolus (В7) 7.0 Каштановая солонцеватая
S. karnatakensis (91) 7.0 Низинная торфяная
S. viridobrunneus (121) 7.0 Низинная торфяная
S. candidus (131) 7.0 Низинная торфяная
S. gelaticus (У11) 7.0 Чернозем обыкновенный
S. violaceoruber (11) 7.0 Серая лесная
S. roseus (Б2) 7.0 Горная мерзлотно-таежная
1 Буква и цифры в скобках обозначают номера штаммов в коллекции кафедры биологии почв МГУ.
Проводили описание культуральных признаков стрептомицетов, выделенных из почв разных типов на среды с разными значениями рН (4.5-5.3; 7.0).
Для исследования динамики цитодифференци-ровки мицелия стрептомицетов использовали следующий метод [9]. Стерильные покровные стекла помещали в чашки Петри с агаризованной средой Гаузе 1 под углом к поверхности среды, засеянной культурой стрептомицета. Чашки инкубировали при 28°С. Стекла вынимали на 3-и, 6-е, 9-е и 15-е сут роста культуры, фиксировали жидкостью Карнуа [10], окрашивали метиленовым синим (1%), переносили на предметное стекло и микроскопировали в оптическом микроскопе (х400, х900).
Изменение значения рН питательной среды в процессе роста культур стрептомицетов регистрировали с помощью индикатора бромкрезоло-вого пурпурового [5] и с помощью портативного рН-метра со стеклянным электродом.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование радиальной скорости роста стрептомицетов на агаризованной питательной среде в диапазоне значений рН от 4.0 до 8.0 показали, что культуры, выделенные из различных почв при значении питательной среды рН 5.3, ха-
рактеризуются общим свойством: наибольшие значения Kr отмечены у них при рН около 5.0; диапазон значений рН, пригодных для роста культур, лежит в пределах рН 4.0-8.0 (рис. 1а). Стреп-томицеты, выделенные из почв при нейтральном значении рН среды, имеют максимальные значения Kr в области значений рН от 6.0 до 7.0, границы роста отмечены при рН от 5 до 9 (рис. 16). Первую группу стрептомицетов мы считаем ацидофильными, вторую - нейтрофильными.
Условие, считающееся в литературе главным для разграничения ацидофильных и ацидотоле-рантных актиномицетов [11], - способность аци-дотолерантных и неспособность ацидофильных актиномицетов расти при нейтральных значениях рН, - не представляется нам достаточно убедительным, так как способность к росту в нейтральных условиях может демонстрировать приспособленность актиномицета к местообитанию - почве, характеризующейся микрозональностью. Поэтому мы используем термин ацидофильные для стрептомицетов, имеющих максимальные показатели радиальной скорости роста в кислой среде.
Отмечена корреляция между значением рН среды, при котором радиальная скорость роста максимальна, и величиной рН питательной среды, при которой культура была выделена из почвы.
Kr, мм/сут
Рис. 1. Диапазоны значений рН, пригодных для роста стрептомицетов: а - выделенных из почв на подкисленные среды (1 - Streptomyces^тозш, 2 - S. хамЫ-chromogenes, 3 - S. viridogenes); б - выделенных из почв на нейтральные среды (1 - S. viridobrunneus, 2 -S. argenteolus, 3 - S. roseus).
Сравнительное исследование культуральных свойств ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов в процессе их роста на подкисленной и нейтральной средах показало, что стрептомице-ты двух групп имеют свои особенности.
Нейтрофильные стрептомицеты оказались либо не способными расти на среде с низкими значениями рН, либо их рост был значительно более слабым по сравнению с ростом на нейтральной питательной среде. У нейтрофильных стрептоми-
цетов при росте на подкисленной среде не образовывался воздушный мицелий, субстратный мицелий был не окрашен, не отмечалось образование растворимого пигмента.
У ацидофильных стрептомицетов на подкисленной среде формировались более крупные колонии по сравнению с колониями на нейтральной среде. Воздушный мицелий образовывался на подкисленной питательной среде значительно позже, чем на нейтральной; отмечалась менее интенсивная окраска субстратного мицелия и митательной среды.
Наблюдение за динамикой дифференцировки мицелия проведено с ацидофильным штаммом Streptomyces fumosus (рис. 2а) и нейтрофильным штаммом Streptomyces roseus (рис. 26).
У ацидофильного стрептомицета уже к третьим суткам роста на среде Гаузе 1 (рН 7.2) формируется колония с развитым субстратным, воздушным мицелием и длинными плотносжатыми спиральными спороносцами (1-3 оборота), споры освобождаются к 9-м сут роста культуры. На среде с рН 6.2 субстратный мицелий и стерильный воздушный мицелий формируются к 3-м сут роста; спороносцы в виде крючков и спиралей формируются к 6-9-м сут роста, освобождение спор отмечено на 15-е сут роста. При рН 5.3 к 3-м сут роста отмечено формирование субстратного мицелия с более толстыми гифами по сравнению с гифами субстратного мицелия, образующегося на среде с более высокими значениями рН; воздушный мицелий стерильный. Спороносцы в виде крючков и петель формируются только на 9-е сут роста культуры, к 15-м сут отмечено образование спиралей. На среде с рН 4.5 голые колонии, лишенные воздушного мицелия, формируются к 3-м сут роста. Стерильный слабо развитый воздушный мицелий образуется только к 15-м сут роста.
(a)
1 ¿•ÜUi,
(б)
pH 4.5
pH 5.3
pH 6.2
pH 7.2
Рис. 2. Морфологическая дифференцировка стрептомицетов на средах с различными значениями рН: а - ацидофильный стрептомицет Streptomyces^тозш. б - нейтрофильный стрептомицет S. roseus.
Таблица 2. Изменение кислотности среды в процессе роста ацидофильных и нейтрофильных актиномицетов
№ штаммов Вид стрептомицета Цвет среды1 с индикатором на 9-е сут роста культуры рН среды на 9-е сут роста культуры
Ацидофильные актиномицеты
11 Б^врЮтусез утйоЬгипиеш Розово-бурая 6.2
А5 Б. утйоЬгиппеш » 6.1
0 Б. /итозш Буровато-розовая 6.2
Е Б. viridogenes Розов
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.