научная статья по теме ОСОБЕННОСТИ РОСТА И НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI Биология

Текст научной статьи на тему «ОСОБЕННОСТИ РОСТА И НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI»

БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2007, том 24, № 5, с. 389-394

УДК 577.3

ОСОБЕННОСТИ РОСТА И НЕКОТОРЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕМБРАН ПРОБИОТИЧЕСКИХ ШТАММОВ Escherichia coli

© 2007 г. К. Степанян12, М. Балаян1, Ä. Василян1, Ä. Пепоян1, Ä. Трчунян2

1Институт молекулярной биологии НАН Республики Армения, 0044 г. Ереван, ул. Асратяна 7 2Кафедра биофизики биологического факультета Ереванского государственного университета, 0025 г. Ереван, ул. Манукяна 1, Республика Армения; электронная почта: Trchounian@ysu.am

Поступила в редакцию 28.04.2007 г.

Показано, что пробиотические штаммы Escherichia coli G35 N 59 из формулы "Окарин", из формулы "АСАП" и комменсальный штамм 5-1, выделенный из кишечника здорового человека, в отличие от штамма дикого типа имеют высокую удельную скорость роста, меньше закисляют наружную среду при сбраживании глюкозы и отличаются меньшим падением окислительно-восстановительного потеницала. Вместе с тем, у этих бактерий, несмотря на сравнимые величины мембранного потенциала, изменены суммарные и ^№-дициклогексилкарбодиимид-чувствигельные величины энергозависимых потоков Н+ и К+ через мембраны и подавлено производство молекулярного водорода. Предполагается, что различия в характеристиках мембраны бактерий, обусловленные, скорее всего, изменениями в протон-транслоцирующей F0F1-АTP-азе, могут приводить к изменениям в росте бактерий и определять их пробиотическое действие.

В последнее время все большее значение в терапии таких желудочно-кишечных заболеваний человека, как инфекционная диарея или хронические воспалительные процессы, приобретает использование живых микроорганизмов-пробиоти-ков. Положительное воздействие пробиотиков обусловлено, скорее всего, комплексным взаимодействием этих микроорганизмов с микрофлорой кишечника и с кишечным эпителием [1]. Предполагаемые механизмы такого воздействия включают в себя стимуляцию как противо-, так и провос-палительного иммунного ответа [2], адаптивный иммунный ответ и образование антител [3]. Связывание микроорганизмов [4], модуляция барьерной функции слизистой [5, 6] и подавление миграции нейтрофилов [7] также могут играть важную роль в действии пробиотиков на течение кишечных заболеваний. Тем не менее механизмы, лежащие в основе пробиотического действия бактерий, особенно на молекулярном уровне, до сих пор неизвестны.

Большинство используемых пробиотиков относится к молочнокислым и бифидобактериям [811], однако в настоящее время интенсивно исследуются и бактерии других родов и видов. В частности, показана пробиотическая активность некоторых штаммов Escherichia coli [12], несмотря на то что комменсальные E. coli в кишечнике человека составляют приблизительно 0.1% находящихся в сравнительно незначительном количестве компонентов кишечной микрофлоры - колиформ. Выявлены некоторые отличия в характеристиках мембраны комменсальных штаммов этих бакте-

рий, выделенных из кишечника больных раком молочной железы [13].

Потому особый интерес представляет сравнительное изучение биоэнергетических характеристик и некоторых транспортных и ферментативных свойств мембран пробиотических штаммов E. coli.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Бактерии и их выращивание;реактивы. В работе использовали штаммы E. coli G35 N 59 из про-биотической формулы "Окарин" [14], E. coli из пробиотической формулы "АСАП" [15], комменсальный штамм E. coli 5-1, выделенный из кишечника здорового человека и обладающий пробиотической активностью (неопубликованные данные). В качестве лабораторного штамма дикого типа брали E. coli МС4100 [16, 17].

Бактерии выращивали в пептонной среде (2% пептон, 0.5% NaCl, 0.2% K2HPO4; рН 7.5) с 0.2% глюкозой в анаэробных условиях, как описано ранее [13, 16-19]. рН ростовой среды определяли с помощью чувствительного рН-метра с селективным электродом типа HJ1131B ("Hanna Instruments", Португалия) и регулировали с помощью NaOH или HCl. О сбраживании глюкозы при анаэробном росте бактерий в указанной среде судили по секреции молочной кислоты и выделению молекулярного водорода [13, 16-19].

Рост бактерий оценивали по увеличению оптической плотности (ОП) суспензии при длине волны 650 нм, определяемой с помощью колоримет-

ра. Удельную скорость роста (ц) рассчитывали в интервале, когда увеличение ОП линейно зависело от времени [13, 16-19].

В работе применяли D-глюкозу (Борисовский завод медицинских препаратов, Беларусь), агар бактериальный, ^№-дициклогексилкарбодиимид (DCC), тетрафенилфосфония (ТФФ+) бромид ("Sigma", США), пептон ("Oxoid", Великобритания или "Sigma", США), стандартные буферные растворы, трис ("Reanal", Венгрия или "Carl Roth GmbH & Co", Германия) и другие реактивы аналитической чистоты.

Мембранный потенциал бактерий рассчитывали по распределению проникающего катиона ТФФ+ между цитоплазмой и наружной средой, определяемому с помощью селективного электрода [13, 18, 19]. Бактерии после отмывки в 10 мМ растворе EDTA, рН 7.5, вводили в экспериментальную среду (20о мМ фосфатно-трисовый буфер, рН 7.5, содержащий 0.4 мМ MgSO4, 1 мМ NaCl и 1 мМ KCl, а также 1 мкМ ТФФ+). Калибровку показаний электрода проводили удвоением концентрации ТФФ+ в среде. Адсорбцию этого проникающего катиона на поверхности клетки учитывали после кипячения бактерий в течение 3-5 мин, а внутриклеточный объем бактерий (цитоплазмы) считали равным 0.85 х 10-6 мкл [13, 18, 19].

Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) среды определяли с помощью титан-силикатного (Eh) электрода типа Э0-021 (Гомельский завод измерительных приборов ГЗИП, Беларусь) и платинового (E'h) электрода типа ЭПВ-01 (ГЗИП, Беларусь) или РТ42В^ ("Hanna Instruments", Португалия), как описано ранее [13, 16-19]. Разница в показаниях этих электродов (в отличие от платинового, титан-силикатный электрод нечувствителен к молекулярному водороду (Н2) или кислороду) позволяет определять выделение Н2 бактериями [16-19]. При этом разница между скоростями падения E'h и Eh в ~4.0 мВ/мин на мг сухого веса однозначно указывает на выделение Н2, что подтверждали химически [16-19].

Изучение транспорта ионов через мембраны бактерий. Перенос ионов Н+ и К+ через мембраны бактерий оценивали по изменению активности соответствующих ионов в наружной среде, определяемому с помощью селективных электродов [13, 16-19]. Показания электродов калибровали титрованием среды с помощью малых количеств 0.1 н HCl и 0.1 мМ KCl соответственно. Потоки ионов выражали в ммоль/мин на единицу количества бактерий в объеме.

Следует отметить, что при отмывке в бескалиевом растворе с малой осмотичностью клетки лишались значительного количества К+ и при переносе в экспериментальную среду с высокой осмотичностью (см. выше) подвергались гиперосмотическому

стрессу. Такие клетки удобны для изучения транспорта ионов Н+ и К+ через мембраны [20, 21].

Другие методы и обработка данных. Бактерии растили и эксперименты проводили при 37°С. При использовании DCC бактерии предварительно инкубировали в среде с этим реактивом в концентрации 0.1 мМ в течение 10 мин. Количество бактерий в единице объема (титр) определяли подсчетом колоний после высева суспензии клеток на твердые среды.

Следует заметить, что обработка бактерий DCC и осмотический стресс не приводили к гибели клеток, титр бактерий не изменялся в течение эксперимента (не показано).

Сухой вес бактерий определяли, как описано ранее [13, 16-19]. Стандартная ошибка среднего арифметического результатов измерений не превышает 5% (если другое значение не приведено). Критерий достоверности (р) приводится для разницы средних величин экспериментальных данных.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Особенности роста пробиотических штаммов E. coli. Рост E. coli в анаэробных и аэробных условиях, когда они осуществляют сбраживание органических субстратов, анаэробное (например, нитрат/нитритное) или аэробное (кислородное) дыхание, изучен достаточно хорошо [13, 16-19, 2224]. Так, в анаэробных условиях при сбраживании глюкозы (см. Экспериментальную часть) эти бактерии (E. coli МС4100) растут с относительно высокой скоростью, в стационарную фазу роста дают хороший выход биомассы (табл. 1).

Как показано в табл. 1, продолжительность скрытой лаг-фазы до логарифмической фазы роста практически одинакова у трех пробиотических штаммов E. coli (G35 N 59, "АСАП" и 5-1) и сопоставима с продолжительностью скрытой лаг-фазы у штамма дикого типа (МС4100). Установлено также, что удельная скорость роста пробиотических штаммов почти в 1.8-2 раза достоверно превышает скорость роста МС4100 (табл. 1). Выход биомассы в стационарную фазу роста у штаммов G35 N 59 и 5-1 несколько ниже, чем у штамма МС4100. У другого пробиотического штамма ("АСАП") показатель максимальной биомассы практически не отличается от этого показателя у штамма МС4100 (табл. 1).

Закисление наружной среды при росте пробиотических штаммов до стационарной фазы роста (разница между значениями рН в начале роста и в начале стационарной фазы) несколько меньше, чем при росте штамма дикого типа МС4100 (табл. 1): достоверная разница наблюдается у штаммов "АСАП" и 5-1. Закисление среды при росте бактерий происходит за счет секреции конечных про-

Таблица 1. Характеристики роста различных штаммов E. coli (глюкозы)

анаэробных условиях при сбраживании сахара

Штамм E. coli Продолжительность скрытой фазы, ч Удельная скорость роста, ч-1 Максимальная биомасса, единицы ОП Изменение рН ростовой среды за период от начала роста до стационарной фазы роста (исходный рН 7.5)

MC4100 G35 N 59 "АСАП" 5-1 2.4 ± 0.1 2.3 ± 0.1 2.3 ± 0.2 2.4 ± 0.1 0.55 ± 0.00 1.18 ± 0.01 (р < 0.001) 1.08 ± 0.02 (р < 0.001) 0.99 ± 0.00 (р < 0.001) 1.26 ± 0.02 1.13 ± 0.03 (р < 0.05) 1.30 ± 0.02 (р > 0.1) 0.98 ± 0.01 (р < 0.01) 2.10 ± 0.02 1.98 ± 0.2 (р > 0.1) 1.91 ± 0.02 (р < 0.05) 1.84 ± 0.02 (р < 0.01)

Примечание. МС4100.

Здесь и далее значение р определено для разности между средними величинами для данного штамма и штамма

дуктов сбраживания сахаров - кислот [25], а также выброса протонов через, например, F^-ATP-азу [16, 26]. Последний процесс может обеспечивать до 40% от общего закисления [27]. Различие в за-кислении среды, таким образом, может быть

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком