УДК 57.087
ОСОБЕННОСТИ СОЛЮБИЛИЗАЦИИ ИНТЕРФЕРОНА бета-tt
ИЗ ТЕЛЕЦ ВКЛЮЧЕНИЯ
© 2015 г. А. С. Журавко#, Н. В. Кононова, А. И. Бобрускин
ООО "Научно-производственный центр ИБХ-РАН", 127473, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10 Поступила в редакцию 09.02.2014 г. Принята к печати 27.02.2014 г.
Разработан новый метод солюбилизации рекомбинантного интерферона бета-lb (IFNP-lb) из телец включения, позволяющий избирательно экстрагировать целевой белок в растворы спиртов — этилового, пропилового и изопропилового. Показано, что наилучшую растворимость IFNP-lb проявляет в 55% растворе пропилового спирта. Данный способ позволяет экстрагировать целевой белок из телец включения на 85—90% и заметно снижает содержание белков Escherichia coli в солюби-лизате по сравнению со стандартными методами.
Ключевые слова: интерферон, солюбилизация, экстракция, TFA, пропанол, тельца включения.
Б01: 10.7868/80132342315040156
ВВЕДЕНИЕ
Интерфероны — это природные белки, принадлежащие к семейству цитокинов [1, 2]. Их молекулярная масса варьирует от 15 до 21 кДа [3]. Идентифицированы 3 основных класса интерфе-ронов: альфа (а), бета (в) и гамма (у) [4]. У каждого вида животных имеется несколько а-интерфе-ронов (в частности, у человека найдено 14 различных генов а-интерферонов), один или несколько в-интерферонов и всегда только один у-интерфе-рон [4, 5]. У большинства интерферонов а-типа пептидные цепи негликозилированы, тогда как в- и у-интерфероны являются гликопротеинами [4]. Все интерфероны обладают противовирусным, имму-номодулирующим, противоопухолевым и антипро-лиферативным эффектами [1, 6]. а- и в-Интерфе-роны представляют собой типичные глобулярные белки (содержание а-спиральных структур составляет 40-75%) [4].
Использование методов генетической инженерии позволило экспрессировать гены интерферо-нов в различных клетках: бактериальных, дрожжевых и эукариотических, что в свою очередь дало возможность создать медицинские препараты и применять их для лечения различных заболеваний [7]. В частности, создание препарата на основе ре-
Сокращения: АФС — активная фармацевтическая субстанция; ЛС — лекарственное средство; ТВ — тельца включения; 0(!пНС1 — гуанидингидрохлорид; 1РКр-1Ъ — реком-бинантный интерферон бета-1Ъ. #Автор для связи (тел.: +7(919) 727-78-01; эл. почта: nastasya_Zh@mail.ru).
комбинантного интерферона в позволило лечить такое заболевание, как рассеянный склероз [8].
Сегодня на российском фармацевтическом рынке доступны два типа ЛС, в которых в качестве активной фармацевтической субстанции (АФС) используется гликозилированный либо негликозилированный варианты рекомбинант-ного в-интерферона человека. Под торговой маркой "Ребиф" [9, 10] продается препарат, где в качестве АФС используется гликозилированный вариант IFNe-1a [11]. Он синтезируется с помощью эукариотической системы экспрессии и обладает специфическим для нее характером глико-зилирования, а именно — содержит олигосахариды, с одним остатком фукозы в каждом. Эти олигосаха-риды могут быть биантенными, трехантенными и тетраантенными (т.е. двух-, трех- и четырехразветв-ленными) [12]. Рекомбинантный вариант, полученный с помощью прокариотической системы экспрессии (IFNe-1b), в отличие от природного белка не гликозилирован [11], содержит ^-конце-вой Met, а Cys17 заменен на Ser17 [5, 11, 13] и также применяется в качестве АФС в препаратах под торговой маркой "Бетаферон" [9, 10]. Первичную структуру IFNe-1b составляют 166 а.о. [14], два из которых являются цистеинами (Cys31, Cys141), образующими внутримолекулярную дисульфидную связь [14, 15]. Кроме этого, в молекуле белка катио-ногенные группы (лизин — 14.5% и аргинин — 6.63%), преобладают над анионогенными, из-за чего его изоэлектрическая точка смещена в область щелочных значений (p/9.1—9.6) [16]. IFNe-1b обладает ярко выраженными гидрофобными свой-
0.035
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 pH
Рис. 1. Зависимость содержания IFNß-1b в солюбили-зате от рН солюбилизирующего раствора. [рН < 4.0 — 0.2-0.4% TFA, рН 4.0 до 5.5-50 мМ CH3COONa, рН 6.0 - 5 мМ №3-цитрат, рН 6.5 - 9.5-20 мМ (Na2 + + №)-фосфат, рН 9.0 - 10.0-20 мМ Трис, рН > 10.0 -20 мМ Arg c 1.5-4 мМ NaOH].
ствами [15, 17] и практически не растворяется в водных растворах при рН 6.0—8.0 в отсутствие детергентов [15, 18]. Поэтому процесс получения ЛС на основе 1РМР-1Ъ на практике представляет собой достаточно сложную и комплексную задачу, одним из этапов решения которой является разработка метода солюбилизации целевого белка из телец включения (ТВ), обеспечивающего высокий выход биологически активного продукта после ренатурации.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При экспресии эукариотических белков в бактериальных клетках некоторые белки при высоком уровне биосинтеза, вследствие отсутствия условий, необходимых для поддержания их в растворимой форме, переходят в нерастворимое состояние, образуя так называемые ТВ [19—21]. Образование ТВ происходит на этапе складывания белка, когда его структура принимает промежуточное состояние (интермедиат) между нативным и полностью развернутым. В этом состоянии молекула термодинамически стабильна и имеет выраженную или частично выраженную вторичную структуру [22]. Поэтому для обеспечения высокого выхода активного белка после ренатурации очень важно предотвратить образование открытых гидрофобных участков аминокислотной цепи белка в процессе солюбилизации и, тем самым, нивелировать процесс формирования агрегатов.
Как известно, растворимость белков в различных растворителях зависит от многих факторов: природы белка, состава, температуры и рН растворителя и других факторов. В результате белки хорошо растворимы либо в воде, либо в водных растворах солей, либо в слабых растворах кислот или щелочей, либо в смеси воды с органическим растворителем (например, ацетона) или растворах детергентов.
Для растворения белков, экспрессированных в виде ТВ, применяют буферные растворы, содержащие хаотропные агенты, такие как мочевина, ОёпИС1, соли тиоциановой кислоты, а также доде-цилсульфонат натрия, ^-лаурилсаркозин и другие детергенты [23—26].
Из литературных данных известно, что белки из ТВ могут быть извлечены вышеперечисленными растворами, имеющими как кислое, так и щелочное значение рН [19]. В связи с этим, был проведен ряд экспериментов по изучению зависимости степени солюбилизации 1РМР-1Ъ из ТВ от рН в области значений 2.0—13.0. Для этого очищенные ТВ солюбилизировали в буферных растворах с различными значениями рН, не содержащих ха-отропных агентов. Количество солюбилизиро-ванного 1РМР-1Ъ для каждого значения рН определяли методом офВЭЖХ.
Из рис. 1 видно, что при значениях рН > 11.0 и рН < 3.0 содержание белка в соответствующих растворах резко увеличивалось. Наибольший выход белка из ТВ наблюдался при значениях рН 2.0 и 12.0. Однако при рН > 12.0 происходила частичная деградация белковой молекулы (рис. 2, 1,4), в результате чего содержание целевого белка снижалось.
Как уже говорилось выше, белки, экспрессиро-ванные в ТВ, чаще всего имеют вторичную структуру, подобную нативной. Поэтому, мы провели ряд экспериментов по изучению солюбилизирующей способности мочевины и ОёпИС1 и устойчивости, выделяемого из ТВ белка к денатурирующему воздействию данных хаотропных агентов при рН 2.0. Для этого исследовали степень солюбилизации 1РМР-1Ъ из ТВ растворами мочевины и ОёпИС1 в различных концентрациях (рис. 3, метод офВЭЖХ) и изменение вторичной структуры солюбилизиро-ванного белка (рис. 4, метод КД в дальней УФ-об-ласти).
Солюбилизация целевого белка раствором рН 2.0, не содержащим мочевину или ОёпИС1, приводила к наибольшему высвобождению 1РЫР-1Ъ из ТВ. По мере увеличения концентрации хаотроп-ных агентов, содержание белка в солюбилизиру-ющих растворах падало, и при концентрации выше 5 М процесс был малоэффективен.
Оценка состояния вторичной структуры 1РЫР-1Ъ в результате анализа спектров КД в дальней УФ-области во всех полученных солюбилизатах
А
-220
-.__ 1
40
41
42
43
44
45 46 мин
Рис. 2. Анализ солюбилизатов с помощью капиллярного электрофореза (ведущий электролит 0.01 М №2В^7 рН 9.5). Электрофореграмма ГРКр-1Ъ, со-любилизированного при рН 13.0 (1), при рН 12.0 (4) и при рН 2.0 (2) в сравнении со стандартным образцом (3). Пики А и Б — продукты деградации белка, пик В — целевой белок.
са £
нч
«
и
Я
св &
н е Я н
О
0.30 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05
0
\ч \ \ чч
1
2
1111 1 - _; 1_в
1 2 3 4 5 6 [Хаотропные агенты], М
Рис. 3. Зависимость содержания 1РКр-1Ъ в солюби-лизате от концентрации 0(!пНС1 (1) и мочевины (2) в солюбилизирующем растворе при рН 2.0.
Стандарт (1)
0 М (2) 2 М (3)
4 М (4)
5 М (5)
В 40
р г 30
Л 20
ч о 10
м
^ 0
2
2м о — 10
Г<1 —20
0
—30
X
—40
200
210
220 230 X, нм
240
250
260
Рис. 4. КД-спектры 1РКр-1Ъ, солюбилизированного из ТВ при рН 2.0 растворами мочевины с концентрацией: 0 (2), 2 (3), 4 (4), 5 М (5), в сравнении с натив-ным белком (1).
2
3
4
показала следующую картину (рис. 4): белок, солю-билизированный 0.3% раствором ТРА (рис. 4, 2), имел структуру, приближенную к структуре на-тивного 1РМв-1Ъ (рис. 4, 1). В данных спектрах доминировала отрицательная полоса с минимумом в области 208 нм, что указывало на неупорядоченную укладку полипептидной цепи. Среднее содержание а-спиралей и в-структур по спектрам УФ-КД в растворе стандарта 1РМв-1Ъ составило 65 и 12% соответственно. Аминокислотные остатки, входящие в неупорядоченные участки полипептидной цепи, по данным КД, составляли 17% от полного числа аминокислотных остатков в молекуле белка.
Увеличение концентрации мочевины выше 1 М вело к образованию протяженных участков спиральных структур белка (до 40% в 5 М мочевине), о чем свидетельствовало появление пика при 200—210 нм (рис. 4, кривые 3, 4, 5). Аналогичные результаты получены для ОёпНС1 (не приведено). Наличие таких участков в солюбилизирован-
ном белке, скорее всего, привело бы к усилению процесса агрегации белковой молекулы в процессе ренатурации, а, следовательно, и к снижению выхода 1РМв-1Ъ.
На основании полученных данных был сделан вывод о том, что оптимальным для сол
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.