БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 3, с. 519-524
= БИОФИЗИКА КЛЕТКИ= =
УДК 577.23:616.36-056.25
О СОБЕННОСТИ CTP УКТУР НО-ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ЦИТОХР ОМНОГО УЧАСТКА ДЫХАТЕЛЬНОЙ ЦЕПИ МИТОХОНДР ИЙ ПЕЧЕНИ В УСЛОВИЯХ АЦЕТАМИНОФЕН -ИНДУЦИР ОВАННОГО ГЕПАТИТА НА ФОНЕ АЛИМЕНТАР НОЙ ДЕПР ИВАЦИИ П Р ОТЕИНА
© 2015 г. О.Н. Волощук, Г.П. Копыльчук
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета им. Ю. Федьковича,
58000, Черновцы, ул. Леси Украинки, 25, Украина;
E-mail: oxbm@mail.ru Поступила в p едакцию 01.09.14 г.
После доработки 07.02.15 г.
И сследована активность ключевого фермента цитохр омного участка дыхательной цепи цито-хромоксидазы, количественное перераспределение митохондриальных цитохромов b, с1, с и ааз, а также активность ключевых ферментов метаболизма гема цитохромов - 8-аминолеву-линатсинтазы и гемоксигеназы - в условиях ацетаминофен-индуцированного повреждения печени на фоне алиментарной депривации протеина. Установлено, что в условиях ацетами-нофен-индуцированного гепатита наблюдается торможение цитохромоксидазной активности и снижение количественного содержания митохондриальных цитохромов на фоне повышения 8-аминолевулинатсинтазной и гемоксигеназной активности. У животных с токсическим повреждением печени, содержавшихся в условиях алиментарной депривации протеина, установлено прогрессирующее снижение количественного содержания митохондриальных цитохр омов b, с1, с, аа3 на фоне повышения активности гемоксигеназы и сохранении активности S-ами-нолевулинатсинтазы на уровне значений контроля. Сделан вывод, что алиментарная депривация протеина является критическим фактором для развития нарушений функционально-структурной целостности цитохромного участка дыхательной цепи и установленные изменения могут рассматриватся как один из возможных механизмов нарушения работы системы биотрансформации энергии в условиях недостаточности белка в рационе.
Ключевые слова: митохондрии, цитохромы b, с1, с, аа3, цитохромоксидаза, Ъ-аминолевулинат-синтаза, гемоксигеназа, алиментарная депривация протеина, ацетаминофен-индуцированное повреждение печени.
C пособность печени к воccтановлению функциональной активности пpи гепатотокси-чеcкиx cоcтоянияx, возникающиx как побочный эффект влияния pяда лекарственных пр епа ратов [1—3], зависит от эффективности работы системы биотрансфор мации энер гии гепатоцитов [4]. С о -стояние энергообеспечения клеток в первую очередь определяется эффективностью работы дыхательной цепи митохондрий, трансформирующей энергию окисления субстратов дыхания кислородом в форму трансмембранной разности электр охимических потенциалов ионов водорода на сопрягающей мембране [5]. В обеспечении энергетических потребностей клетки значительная роль отводится цитохромному участку дыхательной цепи, ключевым ферментом терминального этапа превращения энергии является цитохр омоксидаза, катализирующая
транспорт электронов от цитохрома с на мо-лекуляр ный кислор од [6,7]. Особый интерес вызывает вопрос биохимических механизмов функционирования цитохромного участка дыхательной цепи в условиях ограниченного поступления белков в организм, сопровождающегося возрастанием потребности в донаторах энергии и пластическом материале [8,9]. Последовательность биохимических реакций, определяющих развитие и реализацию дисфункции работы дыхательной цепи митохондрий печени в условиях ее токсического повреждения и алиментарной депривации протеина, на сегодня остается открытым вопросом, требующим подробного исследования. Ранее нами было показано, что в условиях гепатита, индуцированного ацетаминофеном, после предварительного 4-не-дельного содержания крыс на низкопротеино-
вой диете, в митохондриальной фракции клеток печени наблюдается статистически достоверное снижение NADH-убихинонредуктазной и сук-цинатдегидрогеназной активности с одновременным увеличением соотношения редокс-форм никотинамидных коэнзимов (NAD+/NADH) по сравнению с аналогичными показателями в клетках печени животных с экспериментальным гепатитом, содержавшихся на сбалансированном по всем нутриентам пищевом рационе [10]. В то же время в литературе нет систематизированных данных относительно со стояния ци-тохромного участка дыхательной цепи клеток печени в условиях ацетаминофен-индуцирован-ного гепатита на фоне ограниченного содержания белка в рационе, в том числе активности цитохромоксидазы (КФ 1.9.3.1) и пер ера спр е-деления гемсодержащих протеинов электрон-транспортной цепи - цитохромов. Учитывая, что ключевым ферментом биосинтеза гема в митохондриях является фермент 8-аминолеву-линатсинтаза (КФ 2.3.1.37) [11], а ключевым фер ментом его катаболизма - гемоксигеназа (КФ 1.14.99.3) [12], целью нашей работы было определение активности цитохр омоксидазы, исследование количественного перераспределения митохондриальных цитохромов b, с^ с и 0^3, а также активностей ключевых ферментов метаболизма гема цитохромов в условиях ацета-минофен-индуцированного повреждения печени на фоне алиментарной депривации протеина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования проводили на белых нелинейных кр ысах массой 90-100 г и возрастом 2,0-2,5 месяца. Работу с животными осуществляли с учетом положений Хельсинской декларации Всемирной медицинской а ссоциации от 1964 г., дополненной в 1975, 1983 и 1989 гг.
Крыс содержали по одной особи в пластмассовых клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad libitum. Нормирование суточного рациона проводили с учетом принципа парного питания.
И сследовали три гр уппы животных: 1 - крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содер жащиеся на полноценном рационе (Г); 2 - крысы с ацетаминофен-индуциро-ванным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина (НПР+ Г); 3 - контроль (К). Животные 1-й и 3-й группы получали рацион, содержащий 14% белка (в виде казеина), 10% жиров, 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [13]. Жи-
вотные 2-й группы получали рацион, включающий 4,7% белка, 10% жир ов и 85,3% углеводов.
После четырехнедельного содер жания крыс на экспериментальной диете моделирование ацетаминофен-индуцированного гепатита осуществляли путем введения per os ацетаминофена в дозе 1 г/кг массы животных в 2% кра хмальной взвеси на протяжении двух суток с помощью специального зонда [14].
Цер викальную дислокацию крыс под легким эфир ным наркозом о существляли на 31-е сутки эксперимента.
Выделение митохондриальной фракции из гомогената печени проводили с помощью метода дифференциального центрифугирования при 0-3°C [15].
Количественное определение митохондри-альных цитохромов проводили с использованием метода дифферинциальной спектрофото-метрии [7]. Цитохромоксидазную активность определяли с помощью метода, в основе которого лежит способность цитохромоксидазы окислять диметилпарафенилдиамин и а-нафтол (реактив НАДИ) с образованием окрашеного продукта - индофенолового голубого [16].
8-Аминолевулинатсинтазную активность определяли спектрофотометрическим методом [17], ферментативную активность вычисляли с учетом коэффициента молярной экстинции, равного для 8-аминолевулинатсинтазы 0,023-103 М-1см-1 и выражали в нмоль/мин на 1 мг белка. Гемокси-геназную активность определяли по количеству образовавшегося билирубина и выражали в нмоль билирубина на 1 мг белка за 1 мин [18]. Cодержание белка определяли по методу Ло-ури [19].
C татистическую значимость полученных р е-зультатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Ман-на-Уитни с применением программы обработки статистических данных «Statistka 6.0».
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Результаты проведенных исследований показали, что в условиях ацетаминофен-индуци-рованного гепатита в митохондриальной фракции печени наблюдается снижение активности ключевого фермента терминального участка дыхательной цепи - цитохромоксидазы - в 1,7 раза по сравнению с показателями контрольной группы животных (рис. 1), при этом у крыс, предва рительно содер жащихся в условиях алиментарной депривации протеина, достоверной
Рис. 1. Цитохромоксидазная активность в мито-хондриальной фракции печени в условиях ацета-минофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина. К - контроль, Г - крысы с острым ацетаминофен-индуцирован-ным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе, НПР+Г - крысы с ацетаминофен-индуци-рованным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина; * - достоверная разница по сравнению с контролем, ** - достоверная разница по сравнению с группой животных с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащихся на полноценном рационе.
разницы активности цитохромоксидазы по сравнению с животными, содержавшимися в условиях сбалансированного по всем нутриен-там рационе, не установлено. Снижение цито-хромоксидазной активности, как правило, со -провождается нарушением транспорта электро -нов на терминальном участке дыхательной цепи митохондрий, следствием чего является угнетение процесса дыхания и эффективности окислительного фосфорилирования.
Учитывая, что структурным компонентом цитохромоксидазы, обеспечивающим транспорт электронов на молекулярный кислород, являются цитохромы ааъ [20], для объяснения установленного факта нами было исследовано их количественное содержание. Результаты исследований показали, что в условиях гепато-патологии наблюдается снижение количественного содержания цитохромов ааъ в митохонд-риальной фракции печени (рис. 2), более выраженное у крыс, содержавшихся в условиях алиментар ной депривации пр отеина. Вероятно, установленные отличия можно объяснить либо усиленным катаболизмом, либо нарушением синтеза белков, являющихся структурными компонентами митохондриальных цитохромов.
Необходимо указать, что одним из механизмов гепатотоксического действия ацетами-
Рис. 2. Содержание цитохромов b, q, c, аа3 в митохондриальной фракции печени в условиях аце-таминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина. Обозначения, как на р ис. 1.
нофена является связывание его метаболита -N-ацетил-р-бензохинонимина (NAPQI), образующегося при участии ц
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.