научная статья по теме ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА В23/НУКЛЕОФОЗМИНА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА Биология

Текст научной статьи на тему «ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА В23/НУКЛЕОФОЗМИНА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА»

УДК 577.112.855

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРНОГО СОСТОЯНИЯ БЕЛКА В23/НУКЛЕОФОЗМИНА В КЛЕТКАХ ГОЛОВНОГО МОЗГА

© 2014 г. Н. М. Владимирова*, Н. А. Потапенко, Е. А. Сурина, О. М. Вольпина

Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 117997 Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; *электронная почта: vla.ibch@mail.ru Поступила в редакцию 24.04.2013 г.

Нуклеофозмин — полифункциональный белок, представленный в клетках разными структурными формами. В данной работе для анализа состояния нуклеофозмина в нормальных тканях иммунохи-мическим методом впервые помимо моноклональных антител были применены противопептидные антитела к разным формам нуклеофозмина: антитела, специфично выявляющие мономеры всех известных форм белка В23, и антитела, селективные только для мономеров и олигомеров изоформы В23.1. Объектами исследования служили гомогенаты головного мозга, печени, почек, легких и сердца крыс, а также ядра клеток, полученные из препаратов печени и мозга. Обнаружено, что структурное состояние нуклеофозмина в клетках мозга отличается о его состояния в клетках других тканей. Выявлено, что только на иммуноблотах гомогенатов мозга, помимо мономерной, детектируется уникальная олигомерная форма нуклеофозмина, устойчивая к обработке ЗБЗ и видимая в условиях проведения $В$-ПААГ-электрофореза. Анализ нуклеофозмина в мозжечке, коре, амигда-ле, стволе, гиппокампе позволил установить, что нуклеофозмином наиболее обогащены мозжечок и гиппокамп, причем на иммуноблотах обоих препаратов олигомерная форма белка была превалирующей. Состояние нуклеофозмина в пролиферирующих клетках глии и непролиферирующих нейронах мозга изучали с помощью иммунохимического анализа на препаратах первичных культур клеток глии и нейронов. Впервые обнаружено, что клетки глии и нейроны принципиально отличаются по содержанию и структурному состоянию нуклеофозмина. Содержание нуклеофозмина в клетках глии значительно больше, чем в нейронах. На иммуноблотах клеток глии нуклеофозмин детектируется в основном в виде $В$-устойчивых олигомеров, а мономерная форма присутствует в существенно меньшем количестве. На иммуноблотах нейронов видны лишь следовые количества мономерной формы нуклеофозмина.

Ключевые слова: нуклеофозмин, мономеры, $В$-устойчивые олигомеры, клетки глии, нейроны.

Б01: 10.7868/80233475513050228

Нуклеофозмин (белок В23, МРМ 1) принадлежит к семейству ядерных шаперонов — нуклео-плазминов. Первоначально нуклеофозмин был обнаружен в ядрышке и назван ключевым яд-рышковым белком, участвующим в биогенезе рибосом. В настоящее время известно, что он локализован также в нуклеоплазме, а его доля в ядерном матриксе составляет более 20% от общего содержания белка [1]. Обнаружено также, что нуклеофозмин является "челноком", курсирующим между ядрышком, нуклеоплазмой и цитоплазмой [2], и имеет сложную локализацию в фазе митоза [3]. Нуклеофозмин — полифункциональный белок, включенный в многообразную сеть внутриклеточных взаимодействий. Он проявляет шаперонную активность [4], участвует в биогенезе рибосом [5], а также контролирует клеточный ответ на стрессовые воздействия [6, 7], участвует в регуляции клеточного цикла, апопто-

за, пролиферации и малигнизации клеток [8—10]. Роль нуклеофозмина в канцерогенезе сложна и многообразна. С одной стороны, он рассматривается как онкомаркер и возможный протоонко-генный белок, вовлеченный в регуляцию активности и стабильности белков ЛЯБ [11, 12] и р53 [13, 14]. С другой стороны, у него выявлены онко-супрессорные функции [15].

Полифункциональность нуклеофозмина обусловлена как структурой самого белка, имеющего сложную доменную организацию [16], так и существованием его многочисленных форм, образующихся в результате посттрансляционных модификаций изоформ В23.1 и В23.2 (таких, как ацетилирование [17], сумоилирование [18], убик-витинирование [19], фосфорилирование [20]) и образования гомо/гетероолигомеров [21, 22].

Изоформы В23.1 и В23.2 содержат идентичный N-концевой домен, важный для олигомери-зации, шаперонной активности [21, 23, 24] и связывания с ARF [25]. В этом домене локализован сигнал ядерного экспорта. Центральные домены у обеих изоформ, содержащие два кислых участка и два сигнала ядерной локализации, также идентичны. Этот домен критичен для связывания ги-стонов и рибосомных белков [23, 26]. С-концевой домен, важный для связывания нуклеиновых кислот и рибонуклеазной активности, включающий сигнал ядрышковой локализации (NoLS), содержится только в изоформе В23.1 [22, 27]. По этой причине изоформа В23.1 локализуется преимущественно в обогащенном мРНК ядрышке, а изоформа В23.2 — в нуклеоплазме. Показано, что, поскольку изоформа В23.2 способна к образованию гетероолигомеров с изоформой В23.1, она может локализоваться также в ядрышке и модулировать РНК-связывающую и эндонуклеазную активность изоформы В23.1 [16, 22].

В настоящее время большинство сведений о свойствах изоформ В23.1 и В23.2 получено в результате анализа препаратов рекомбинантных белков, продуктов экспрессии в E. coli плазмид, содержащих кДНК этих изоформ [16, 21—25]. В этих экспериментах было выявлено, что обе изо-формы чрезвычайно склонны к образованию го-мо- и гетероолигомеров различного изоформного состава с молекулярной массой 210—230 кДа, соответствующих пента-/гексамерам [9, 20, 24]. Для их обнаружения были использованы принципиально различные методы детекции: гель-фильтрация, седиментационный анализ и "нативный" электрофорез в ПААГ. В этих работах оценено влияние концентрации одновалентных катионов и Mg2+ на сдвиг мономер-олигомерного состояния нуклеофозмина. Высказано предположение [21], что в клетках, где концентрация одновалентных катионов составляет 140—160 мМ, а концентрация Mg2+ около 0.5 мМ, нуклеофозмин существует преимущественно в форме олигомеров, и именно олигомеры белка В23 участвуют в связывании с Arf [25] и РНК [22], проявляют шаперон-ную [23] и РнК-азную [16, 28] активность, а мономеры изоформы В23.1 связываются с ДНК [28].

Большую информацию об архитектуре олиго-меров и характере межмолекулярных контактов дал рентгеноструктурный анализ белка NO38 Xenopus laevis, аналога нуклеофозмина человека [23]. Получены важные данные о связи структурной организации олигомеров NO38 с проявлением их шаперонной активности в отношении ги-стонов [23].

Следует отметить, что свойства и структура белков, полученных путем гетерологичной экспрессии, часто отличается от свойств эндогенных белков. Так в опухолевых клетках, где резко возрастает содержание нуклеофозмина, он подвергается разнообразным структурным изменениям

- как гена, так и самого белка, приводящим к появ-

- лению новых структурных форм [9, 10]. Выявле-

- но, что при злокачественных заболеваниях крови н наиболее часто повреждается (мутации, делеции, л транслокации) ген нуклеофозмина [29, 30].

а Мутации С-концевого участка изоформы

- В23.1 представляют собой наиболее частое гене- тическое изменение, идентифицированное на се-и годняшний день у больных острым миелоидным х лейкозом с нормальным кариотипом. Мутантные

- изоформы белка теряют сигнал ядрышковой ло-1, кализации и имеют аномальную цитоплазматиче-о скую локализацию. При ряде злокачественных

- заболеваний крови ген нуклеофозмина "сливает-а ся" с различными генами-партнерами, такими ', как гены киназы анапластической лимфомы, ре- цептора ретиноевой кислоты а и фактора 1 мие-а лоидного лейкоза, образуя гибридные (химер- ные) белки. Такие мутации и транслокации приводят к уменьшению содержания белка дикого типа в ядрышке за счет образования его аномально ных форм и гетероолигомеров, состоящих из му- тированных/химерных и нормальных форм бел-х ка, изменению его нормальной локализации и , нарушению взаимодействия с онкосупрессорами В р53 и ЛЯБ [10, 31].

- В настоящее время анализ нуклеофозмина в

- солидных опухолях состоит, в основном, из оцен-о ки уровня его экспрессии. Данные о структурном

- состоянии белка весьма ограничены. Показано, я что при раке печени, яичников, предстательной

- железы, толстого кишечника, желудка содержа,- ние нуклеофозмина резко увеличивается [32, 33],

а при раке молочной железы уменьшается [34].

о Есть лишь данные о структурном состоянии нук-

в леофозмина в клетках больных раком печени. В

- опухолевых клетках этих больных обнаружена е укороченная в М-концевом домене (на ~1 кДа)

- форма нуклеофозмина, образующая олигомеры,

- расщепляемые гранзимом В и выявляемые на им- муноблотах (в условиях 8Э8-ПААГ-электрофо-и реза) как белки с молекулярной массой прибли-

- зительно 200—220 кДа [33]. Такие уникальные

- олигомеры, названные 8Э8-устойчивыми, не об- наружены в аналогичных условиях на имму-. ноблотах клеток нормальной и циррозной пече-

- ни. В то же время в клетках нормальной и цирроз-в ной печени олигомерные формы нуклеофозмина 8 существуют и могут выявляться при "нативном" а гель-электрофорезе (без использования

- [33]. 8Э8-устойчивые олигомеры нуклеофозмина

- также обнаружены нами и другими авторами на

- иммуноблотах нуклеофозмина в культуре клеток карциномы шейки матки человека НеЬа [24, 35].

а На иммуноблотах нуклеофозмина клеток НеЬа с

- применением денатурирующих условий обработ-х ки образца и электрофореза видны три дискрет- ные полосы в зоне олигомеров (190—230 кДа) на- ряду с мономерами нуклеофозмина [35]. Анализ м М-концевых аминокислотных последовательно-

стей белковых полос (до и после деформилирова-ния), соответствующих зонам мономеров и олиго-меров нуклеофозмина, показал, что N-концевые аминокислоты зоны мономеров и олигомеров нуклеофозмина блокированы, причем не фор-мильной защитной группировкой. Анализ С-кон-цевых аминокислотных последовательностей белков, входящих в состав олигомерных комплексов, с помощью карбоксипептидаз позволил впервые показать присутствие двух изоформ нуклеофозмина В23.1 и В23.2 в составе олигомерных комплексов и отсутствие других белков [35].

Для дальнейшего анализа состояния нуклеофозмина из клеток HeLa нами разработана стратегия выделения и структурного анализа изоформ нуклеофозмина с применением арсенала методов белковой химии [36].

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком