ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 8, с. 930-942
= ГЕНЕТИКА МИКРООРГАНИЗМОВ =
УДК 575.1:579.841.11:579.842.11
ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ГЕНОМА phi297 - УМЕРЕННОГО БАКТЕРИОФАГА НОВОГО ВИДА, АКТИВНОГО НА Pseudomonas aeruginosa
© 2013 г. С. В. Крылов1, А. М. Кропинский2, О. В. Шабурова1, К. А. Мирошников3,
Е. Н. Чеснокова1, В. Н. Крылов1
Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова Российской академии медицинских наук, Москва 105064 e-mail: sergey.krylov.mech.inst@mail.ru 2Отдел клеточной и молекулярной биологии Университета Гелф, Гелф, Онтарио N1G 2W1, Канада
e-mail: kropinski@uoguelph.ca 3Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Москва 119997 e-mail: kmi@ibch Поступила в редакцию 25.12.2012 г. Окончательный вариант получен 18.03.2013 г.
Рассматривается и обсуждается структура генома и свойства умеренного бактериофага phi297 Pseudomonas aeruginosa. Из анализа результатов секвенирования и аннотирования сделан вывод, что геном phi297 обладает мозаичной структурой, которая сформировалась при комбинации блоков генов бактерий и/или их фагов, относящихся к отдаленным в систематическом отношении группам микроорганизмов. Результаты анализа уровня и характера ДНК-гомологии phi297 с секвенирован-ными к настоящему времени геномами родственных бактериофагов Р. aeruginosa интерпретируются с позиции возможности активной миграции фагов этой группы между разными видами бактерий.
DOI: 10.7868/S0016675813080079
Умеренные бактериофаги Pseudomonas aeruginosa на основании оценки перекрестной гомологии геномов ранее были распределены в две группы [1—3]. В одну группу вошли четыре вида фа-гов-транспозонов (ФТ), в другую — шесть видов фагов, не проявлявших родства с ФТ. Внутри каждой из этих групп фаги разных видов проявляют гомологию ДНК, но ее характер существенно различается. В группе ФТ гомология легко определима и локализована на правых концах геномов фагов обоих видов, в области расположения структурных генов. Их мозаичная структура свидетельствует о многочисленных внутри- и межвидовых обменах модулями между ФТ [2—5]. С другой стороны, геномы умеренных фагов, не родственных ФТ, проявляют гомологию разной степени при попарном сравнении лишь определенных фагов, отнесенных к разным видам [1]. Изучение геномов новых умеренных фагов должно прояснить происхождение гомологии между ними и определить, в какой степени этот признак характерен для группы умеренных фагов, не относящихся к группе фагов-нетранспозонов P. aeruginosa. Свойства нелизогенизирующего фага phiPMG1 (GenBank: HQ711985.1), относящегося к виду D3, и структура его генома описаны ранее [6]. В общих чертах геном phi297 (GenBank: HQ711984.1) рассматривался ранее и был отмечен мозаичный тип его структуры в работе [7], где об-
суждались возможности использования в фаготерапии фага phiPMG1 и вирулентных вариантов фага phi297. В настоящей работе нами было проведено подробное аннотирование генома бактериофага phi297 и сравнение его с геномами родственных фагов. На основании результатов этого анализа делается попытка объяснения некоторых особенностей развития фага phi297, которые являются следствием мозаичности его генома. Кроме рассматривавшихся в предыдущей работе геномов фагов D3 (GenBank: AF165214.2) и F116 (NCBI Reference Sequence: NC_006552.1) мы провели общее сравнение геномов phi297 и недавно описанного фага YMC/01/01/P52_PAE_BP (GenBank: JX403939.1) [8].
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Бактериофаги. В работе использовали бактериофаг phi297 (дикого типа), активный на P. aeruginosa, и его нелизогенизирующий мутант phi297vir из коллекции лаборатории генетики бактериофагов (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН). Бактериофаг D3 получен от проф. B. Holloway (Австралия).
Бактерии. Штамм Pseudomonas aeruginosa PAO1 получен от проф. B. Holloway (Австралия). Лизогенные штаммы P. aeruginosa PAO1(D3),
PAO1(phi297) отобраны в лаборатории генетики бактериофагов (НИИВС им. И.И. Мечникова РАМН).
Общие методы работы с бактериофагами и бактериями. Питательные среды, растворы, условия культивирования описаны в [9, 10]. Получение фага в высоком титре: чашки Петри с агаризован-ной средой LB (1%-ный бактотриптон, 0.5%-ный дрожжевой экстракт, 1% NaCl, 1.5%-ный агар в дистиллированной воде) заливали слоем полужидкого агара с добавлением используемого штамма бактерий и на поверхность наносили бактериофаг. После ночной инкубации при 37°С полужидкий слой агара снимали, ресуспендиро-вали в физиологическом растворе (0.9% NaCl) и центрифугировали при 8000—12000 об/мин. Надо-садок, содержащий фаг, очищали и концентрировали центрифугированием в градиенте плотности CsCl (Ultramicro centriphuge Hitachi, Япония, swing rotor S52ST, 25000 g) с последующим диализом против фагового буфера ТМ (10 мМ Трис-HCl (pH 7.5) 10 мМ MgCl2, 20 мМ NaCl).
Электронная микроскопия фаговых частиц. Фаговые частицы наносили на медные сеточки для электронной микроскопии диаметром 3 мм, покрытые углеродной пленкой, и окрашивали на каплях 1%-ного раствора уранилацетата 2 раза по 30 с.
Изображения получали в электронном микроскопе Tecnai G-12 (FEI, Голландия) при ускоряющем напряжении 120 кВ в условиях низкой дозы электронов на квадратный ангстрем для предотвращения повреждения образцов под воздействием электронного пучка. Изображения фиксировали с помощью ПЗС камеры Eagle (FEI, Голландия) с увеличением 52000.
Выделение ДНК, рестрикционный анализ. Подготовка, очистка и концентрирование образцов фагов — как описано выше. Выделение ДНК проводили фенольным методом, переваривание ДНК эндонуклеазами (Fermentas) — в соответствии с прилагаемыми инструкциями, электрофорез в агарозном геле — как описано в [11].
Аннотирование и сравнение геномов разных фагов осуществлялось с использованием программы BLAST на сервере NCBI [12] и программ UGENE, Gepard [13, 14]. При поиске гомологичных участков ДНК между геномами phi297, phiPMG1 и D3 был выбран параметр величины окна 135 пн.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Общая характеристика бактериофагаphi297
Бактериофаг phi297 Pseudomonas aeruginosa относится к семейству Syphoviridae. По морфологии и размерам частицы phi297 не отличаются от фагов D3 и phiPMG1 (рис. 1). Фаг phi297 дикого типа образует очень характерные негативные коло-
нии (НК) с четко отграниченным в центре ростом лизогенных бактерий и однородно прозрачной зоной лизиса вокруг, его НК отличаются от НК D3-подобных фагов и их мутантов (рис. 2). Лизогени-зация бактерий фагом phi297 носит нестабильный характер и лизогены выщепляют при делении чувствительные клоны. Как фаг phi297, так и его вирулентный вариант phi297vir неспособны инфицировать штамм P. aeruginosa PAO1, лизо-генный по фагу D3 (профаг D3 изменяет адсорбционные свойства бактериальной поверхности (лизогенная конверсия)) [15]. Фаг phi297 также обладает конвертирующей активностью, но в меньшей степени, чем фаг D3, который на газоне лизогенных бактерий P. aeruginosa PAO1(phi297) образует с низкой эффективностью (около 0.1) мелкие НК, не имеющие типичной морфологии.
В опытах по определению спектра литической активности D3-подобных бактериофагов и их мутантов было обнаружено, что в отличие от других фагов этой группы и собственных vir-мутантов phi297 способен развиваться на газонах некоторых клинических изолятов P. aeruginosa, перманентно образующих большое количество алгината. Причина этого свойства остается непонятной, но оно представляет интерес для дальнейшего исследования особенностей физиологии фага phi297.
Результаты аннотирования генома фага phi297
Геном бактериофага phi297 (GenBank: HQ 711984) содержит 49135 пар нуклеотидов (пн), представленных 69 открытыми рамками считывания (ОРС). Среднее содержание ГЦ = 62.15%. Величины значений ГЦ состава и skew Г-Ц и А-Т изменяются несколько раз по длине генома (рис. 3).
Аннотирование последовательности генома phi297 обнаружило наличие участков гомологии с фрагментами ДНК разных штаммов Pseudomonas aeruginosa, представленных в базе данных NCBI. Эта гомология обусловлена, по-видимому, присутствием в составе ДНК бактериальных штаммов фрагментов геномов фагов, родственных phi297. Наибольший уровень гомологии, 36%, обнаруживается с клиническим изолятом, устойчивым к антибиотикам P. aeruginosa NCGM2.S1 (NCBI Reference Sequence: NC_017549.1).
Геном phi297 проявляет фрагментарную гомологию разной степени с геномами ряда бактериофагов P. aeruginosa. Наибольшая гомология обнаруживается с хорошо изученными фагами D3 и F116 и с недавно описанным бактериофагом YMC/01/01/P52_PAE_BP, для которого известна последовательность нуклеотидов (GenBank: JX403939.1) [8].
Для бактериофагов D3 и F116 суммарно гомология составляет 20234 пн, из которых 2/3 — участки, гомологичные D3. С учетом генов
phi297
D3
phiPMG1
Рис. 1. Морфология частиц D3-подобных бактериофагов P. aeruginosa phi297, D3 и phiPMG1.
phi297, не имеющих прямого родства с генами фагов F116 или D3, но кодирующих продукты, сходные с генопродуктами бактерий рода Pseudomonas и родственных им Burkholderia, доля
генома рЫ297, имеющая признаки родства с псевдомонадами и их фагами, существенно возрастает. Можно допустить, что псевдомонады являются основным хозяином, в котором происходи-
1 2 3 4 5
Рис. 2. Различия в характере роста В3-подобных бактериофагов: D3 (1), phi297 (2), нелизогенизирующего фага phiPMGl (3), нелизогенизирующих мутантов phi297vir (4) и D3c1 (5) на газоне P. aeruginosa PAO1.
ло формирование генома phi297. Именно наличием таких фрагментов объясняется перекрестная гомология, свойственная геномам разных видов умеренных фагов P. aeruginosa, описанная ранее [1]. В то же время в геноме phi297 имеется значительный участок, в котором закодированы продукты, проявляющие высокий уровень сходства с продуктами бактерий и их фагов, относящихся к отдаленной в систематическом отношении группе кишечных бактерий (табл. 1).
Всего в геноме phi297 выявлено 19 участков гомологии с последовательностями нуклеотидов фагов F116 и 10 участков гомологии с фагом D3. Некоторые гены фагов F116 и D3 в геноме phi297 представлены гомологичными у
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.