научная статья по теме ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ИНУЛИНАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ Химия

Текст научной статьи на тему «ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ИНУЛИНАЗ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ»

УДК 57.012.5:577.325

ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ИНУЛИНАЗ РАЗЛИЧНОГО

ПРОИСХОЖДЕНИЯ

© 2014 г. М. Г. Холявка, Т. А. Ковалёва, М. В. Гречкина, И. В. Останкова, В. Г. Артюхов

Воронежский государственный университет, Воронеж 394006 e-mail: holyavka@rambler.ru Поступила в редакцию 20.03.2013 г.

Исследована структурная организация инулиназы дрожжевого, грибного и растительного происхождения. Для определения молекулярной массы и структуры ферментов использовали подход, заключающийся в сочетании атомно-силовой микроскопии с методами динамического светорассеяния, гель-хроматографии и электрофореза. Показано, что инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus niger образуют гетеродимеры, а инулиназы из клубней Helianthus tuberosus представлены как димерной, так и мономерной формами. Обсуждается вопрос о роли различных форм в проявлении функциональной активности молекул инулиназ.

DOI: 10.7868/S055510991401005X

Изучение структуры и свойств инулиназ (КФ 3.2.1.7) имеет теоретическое и прикладное значение. Эти ферменты участвуют в углеводном метаболизме высших растений и микроорганизмов, играют одну из ключевых ролей в контроле процессов клеточной дифференцировки и развития. Инулиназы также могут быть использованы в промышленности при производстве сахаров с различной степенью полимеризации, фруктозы и инулооли-госахаридов — важных компонентов функционального питания, снижающих риск возникновения сахарного диабета, кариеса и ожирения.

Актуальными и перспективными являются исследования особенностей структуры инулиназ и родственных им ферментов. Для инвертазы из Thermotoga maritima [1], экзоинулиназы из Aspergillus awamori [2] и фруктан-1-экзогидролазы из Cichorium intybus [3] предложены модели пространственной структуры. Однако до сих пор не выяснено, какие гликозидгидролазы (GH 32) образуют олигомеры, а какие существуют в мономерной форме.

Детальное изучение белковых макромолекул классическими методами биохимии в сочетании с биофизическими методами позволяет выявить структурно-функциональные особенности ину-линаз, механизмы регулирования каталитической активности ферментов и способы целенаправленного изменения их характеристик.

В последние годы в научной литературе активно обсуждается вопрос о регулировании соотношения мономерных и димерных форм белковых макромолекул как эффективного пути направ-

ленного изменения функциональной активности сложных ферментных систем.

Для исследования молекулярных особенностей белков в настоящее время успешно применяются различные сочетания классических методов биохимического анализа и современные биофизические подходы, в том числе метод атомно-силовой микроскопии (АСМ). В последние годы зондовая микроскопия становится одним из основных методов прямой визуализации биополимеров, отдельных вирусов, клеток и мембран.

Для изучения молекулярной организации ину-линаз нами был использован комплексный подход, заключающийся в сочетании АСМ с методами динамического светорассеяния, гель-хроматографии и электрофореза.

Цель работы — изучение структуры инулиназ различного происхождения.

МЕТОДИКА

Объект исследования. Объектами исследования были инулиназы из Kluyveromyces marxianus и Aspergillus niger, а также три фракции, выделенные из Helianthus tuberosus, обладающие инулиназной активностью, которые были названы инулиназа I, II и III. Гомогенные фракции инулиназы из K. marxianus и H. tuberosus получали в лаборатории кафедры биофизики и биотехнологии Воронежского государственного университета. Ферментный препарат инулиназы из Aspergillus niger фирмы "Sigma Aldrich" (Германия) подвергали дополнительной очистке.

2

17

В качестве субстрата использовали инулин фирмы "MP Biomedicals" (Германия) из корней цикория с молекулярной массой 5000 Да.

Содержание белка определяли методом Лоури, каталитическую активность фермента — резорциновым методом, измеряя оптическую плотность (ОП540) на фотоэлектроколориметре КФК-3 (Россия) [4]. За единицу каталитической активности инулиназы принимали такое количество фермента, которое катализирует образование 1 мкМ фруктозы за 1 мин.

Культивирование дрожжей Kluyveromyces mar-xianus. Глубинное культивирование дрожжей K. marxianus Y-303 проводили в колбах емкостью 500 мл, содержащих по 50 мл питательной среды, в течение 72 ч на лабораторной качалке. Для выращивания дрожжей K. marxianus использовали питательную среду, содержащую (%): пептон — 1.0, дрожжевой экстракт — 0.5, инулин — 2.0. Засев проводили водной суспензией дрожжей. После окончания выращивания биомассу собирали центрифугированием при 250 g 10 мин, промывали физиологическим раствором для удаления остатков питательной среды, снова центрифугировали 10 мин при 250 g. Промытую биомассу продуцента сушили при 25—27°С. Фермент экстрагировали 10%-ным NaCl в течение 1 ч при 37°С.

Осаждение белков ацетоном. Инулиназу из экстракта осаждали предварительно охлажденным ацетоном в соотношении экстракт—ацетон 1 : 4 (об./об.). Осадок отделяли центрифугированием при 250 g 15 мин.

Гель-фильтрация на сефадексе G-25. Для отделения от низкомолекулярных примесей проводили гель-фильтрацию на сефадексе G-25 фирмы "Pharmacia" (Швеция), на колонке (1.5 х 11 см) при скорости элюции 12 мл/ч. Объем нанесенного образца — 3 мл. В каждой фракции (2 мл) определяли активность инулиназы. Фракции, обладающие максимальной ферментативной активностью, объединяли и использовали для дальнейшей очистки.

Ионообменная хроматография на ДЭАЭ-целлю-лозе. На последующей стадии очистки инулиназы применяли ионообменную хроматографию на ДЭАЭ-целлюлозе. После предварительной обработки ДЭАЭ-целлюлозу помещали в колонку размером 2 х 22 см и промывали 0.1 М ацетатным элюирующим (рН 4.7) буфером. На колонку вносили 2 мл раствора фермента, после сорбции белка элюцию проводили в градиенте концентрации NaCl 0.005—0.2 М (для инулиназы из K. marxianus и A. niger) или в градиенте рН элюирующего 0.1 М фосфатно-цитратного буфера 8.0—4.0 (для инулиназы из H. tuberosus). Скорость элюции — 12 мл/ч.

Фракции, содержащие инулиназу, объединяли и использовали для дальнейшей очистки.

Гель-хроматография на сефадексах G-150 и

G-200. Гель-хроматографию проводили на колонке с сефадексом G-150 или G-200 фирмы "Pharmacia" (Швеция). На колонку наносили 1 мл раствора ферментного препарата. Элюцию белковых фракций проводили 0.1 М ацетатным буфером, рН 4.7 со скоростью 12 мл/ч.

Для разрушения четвертичной структуры ферментов применяли раствор 3.5 х 10-5 М Na-ДДС.

При определении кажущейся молекулярной массы инулиназы пользовались калибровочной кривой, для построения которой через колонку пропускали следующие белки-метчики (кДа): ката-лаза — 230, бычий сывороточный альбумин (БСА) — 68, сывороточный альбумин человека (САЧ) — 67, интерферон — 22, цитохром с — 13. Калибровочную кривую строили, откладывая десятичный логарифм молекулярной массы белка-метчика, по оси абсцисс — объем элюции (мл).

Электрофорез в ПААГ. Молекулярную массу фермента определяли при электрофорезе в ПААГ модифицированным методом Дэвиса [5]. Концентрация акриламида в мелкопористом геле — 7.5%, крупнопористом геле — 4%. На пластину наносили образец объемом не более 200 мкл, сверху наслаивали электродный трис-глицерино-вый буфер, рН 8.3. В качестве маркера электро-форетического фронта использовали бромфено-ловый синий. Разделение проводили в камере для вертикального электрофореза белков и нуклеиновых кислот УЕ-2М ("Хеликон", Россия) при 0—4°С. Образцы наносили в 40%-ном растворе сахарозы.

По окончании электрофореза белковые полосы окрашивали нитратом серебра по методу М.В. Не-стеренко [6]. Не связавшийся с белком краситель отмывали, помещая пластину в 7%-ный раствор ледяной уксусной кислоты.

При определении кажущейся молекулярной массы инулиназы применяли метод электрофореза в ПААГ с Na-ДДС. Для построения калибровочной кривой использовали следующие белки-метчики (кДа): фосфорилаза b — 97, бычий сывороточный альбумин — 68, овальбумин — 45, углеродистая ан-гидраза — 30, ингибитор трипсина — 21 и а-лакталь-бумин — 14.4. При построении калибровочной кривой по оси ординат откладывали десятичный логарифм молекулярной массы белка-метчика, по оси абсцисс — Rf белка.

Электрофорез для определения активности инулиназы осуществляли так же, как и обычный электрофорез, за исключением стадии проявления образцов. Пластину для окрашивания сначала помещали на 20 мин в раствор ину-

лина (5 х 10-4 моль/л) при 50°С, затем переносили в раствор, содержащий резорцин (1 мг/мл) и соляную кислоту (30%) и наблюдали за проявлением полос.

Атомно-силовая микроскопия. Для подготовки образцов пластинки свежесколотой слюды (1.5 х 1.5 см) в течение 5 мин инкубировали с 5 мл раствора фермента. Излишки жидкости аккуратно удаляли и высушивали полученные пробы в эксикаторе с влажностью 5—10% в течение нескольких часов.

Изображение поверхности молекулы инулиназы и ее субъединиц получали на сканирующем зондо-вом микроскопе SOLVER P47PRO ("НТ-МДТ", Россия) в лаборатории наноскопии и нанотехноло-гии Центра коллективного пользования на оборудовании Воронежского государственного университета. В работе с ферментом дрожжевого происхождения использовали зонды NSG 20 и NSG 11, для экспериментов с растительными и грибными ферментами применяли кантилеверы марки HA_NC.

Определение размеров молекул методом динамического светорассеяния. Размеры инулиназы и ее субъединиц определяли методом динамического светорассеяния на приборе Photocor complex (ООО "Фотокор", Россия) лазер — гелий-неоновый, X = 647 нм. Форма белковой глобулы принимали за идеальную сферическую. Полученные данные обрабатывали в программе DynaLS. Концентрация инулиназы составляла не менее 1 мг/мл.

Статистическая обработка результатов экспериментов. Статистическая обработка полученных ре-

зультатов проводилась с использованием ¿-критерия Стьюдента при уровне значимости 5%.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В результате очистки были получены препараты инулиназы из K. marxianus со степенью очистки 39.8 и выходом фермента 13.5% и три фракции инулиназ, названные нами I, II и III, из H. tubero-sus со степ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком