ВЕСТНИК ЮЖНОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА Том 9, № 1, 2013, стр. 71-76
МЕДИЦИНА
УДК 0015:616-006.3.04:615.277.3-059
ОСОБЕННОСТИ ВЛИЯНИЯ цАМФ-МОДИФИЦИРОВАННОЙ ХИМИОТЕРАПИИ НА БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА САРКОМЫ 45 И ПРОДОЛЖИТЕЛЬНОСТЬ ЖИЗНИ ЖИВОТНЫХ-ОПУХОЛЕНОСИТЕЛЕЙ
© 2013 г. О.И. Кит1, А.И. Шихлярова1, Г.К. Максимов1, И.А. Новикова1, М.А. Акименко1
Изучено влияние цАМФ-модифицированной химиотерапии опухолей больших объемов на гетерогенность популяции, скорость пролиферации опухолевых клеток и на продолжительность жизни животных-опухоленосителей. Показано, что включение цАМФ в схему противоопухолевой терапии саркомы 45 позволило получить ряд преимуществ по сравнению с монотерапией циклофосфаном. Выявлена возможность трансформации гетерогенных опухолевых клеток в диплоидные клоны в 100% случаев, минимизация их скорости и индекса пролиферации. В крови отмечено снижение числа апоп-тирующих лимфоцитов, повышение содержания живых дееспособных иммунокомпетентных клеток. Активация факторов повышения противоопухолевой резистентности организма под влиянием цАМФ способствовала увеличению продолжительности жизни животных на 30%.
Ключевые слова: циклический аденозинмонофосфат (цАМФ), химиотерапия, саркома, лимфоциты, ДНК-цитометрия, пролиферация, апоптоз.
Одним из актуальных вопросов фундаментальной онкологии является разработка способов сопроводительной терапии рака, повышающей эффективность лечения не только в отношении ингибирования роста опухоли, но и регуляции механизмов жизнеобеспечения и продолжительности жизни организма-опухоленосителя.
Представляется перспективной возможность целенаправленной регуляции биологических процессов через системы вторичных мессенджеров (аде-нилатциклазу, цАМФ, цГМФ, фосфоинозитиды, кальциевый и др. механизмы), оказывающих непосредственное действие на геном клетки [1, 2]. При всей сложности и многоэтапности этих процессов принципы взаимодействия ядра и цитоплазмати-ческого окружения сохраняются: поверхностный рецептор - нуклеотидциклаза - цАМФ (цГМФ). На основе положительной обратной связи может быть реализован механизм управления дифференциальной активностью генов со стороны белковых структур клетки.
Содержание ДНК в клетках и интенсивность клеточной пролиферации являются важными параметрами, характеризующими потенцию злокачественного роста, а плоидность опухолевых клеток рассматривается как интегральный показатель по-
1 Ростовский научно-исследовательский онкологический институт Минздрава России, 344037, Ростов-на-Дону, 14-я линия, 63; e-mail: rnio@list.ru
ведения опухоли. При разных формах онкопатоло-гии количество ДНК не всегда бывает одинаковым (диплоидным) и отклоняется от нормального содержания (анеуплоидия), претерпевая структурную трансформацию [3-5]. Большинство авторов полагают, что содержание ДНК в опухолевых клетках является единственным достоверным фактором, позволяющим судить о прогнозе прогрессирования опухолевого процесса и продолжительности жизни при раке различной локализации [6-9]. При добавлении в схему противоопухолевой терапии цАМФ можно рассчитывать на преимущество такого сочетания, поскольку помимо снижения интенсивности клеточной пролиферации опухоли возможен позитивный эффект на уровне организма: повышение противоопухолевой резистентности и увеличение продолжительности жизни. Известные в литературе метаболические эффекты цАМФ демонстрируют продление сроков жизни у животных с перевитыми опухолями. Особую актуальность приобретает возможность включения цАМФ в схему терапии местно-распространенных форм рака с высокой пролиферативной активностью и летальностью.
Целью работы явилось изучение влияния цАМФ-модифицированной химиотерапии опухолей больших объемов на гетерогенность популяции и скорость пролиферации опухолевых клеток, а также на продолжительность жизни животных-опухоленосителей.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Эксперименты проведены на 45 белых беспородных самцах крыс массой 220±30 г разводки вивария Ростовского научно-исследовательского онкологического института. Штамм саркомы 45 получен из НИИ канцерогенеза Российского онкологического научного центра РАМН им. Н.Н. Блохина. Условия проведения исследований соответствовали международным регламентациям экспериментов на животных [10]. После подкожной перевивки клеток саркомы 45 (С-45) наблюдали за ростом опухоли, рассчитывая объем по формуле Шрека для эллипсоида. По достижению объемов опухоли 2,5-3,5 см3, превышающих в три раза объемы, рекомендуемые для начала экспериментальной терапии, производили лечебные манипуляции: введение через желудочный зонд цАМФ и внутрибрюшинно - раствор циклофосфана (ЦФ).
Процедура введения цАМФ состояла из последовательности трех доз по 0,01 мг/мл раствора (суммарно 0,03 мг/мл) через каждые два часа начиная с 10 часов утра. Использовали кристаллический порошок цАМФ фирмы "SIGMA-ALDRICH", Germany (Prod. of USA). Циклофосфан вводили в дозе 50 мг/кг (суммарная доза 200 мг/кг) в период между 15 и 16 часами трижды в течение курса с интервалом в пять дней.
При изучении ДНК-цитометрических параметров опухоли использовали Cycle TEST™ PLUS DNA Reagent Kit с дезагрегирующим устройством
BD Medimachine. Образцы после окрашивания анализировали на проточном цитофлуориметре BD Facs Cantooll, оборудованном модулем дискриминации дуплетов. Диплоидным стандартом служили лимфоциты крови экспериментальных животных. Данные обрабатывали с помощью программы ModFit LT.
Для исследования реактивности иммунной системы нами были одновременно оценены два типа реакций лимфоцитов периферической крови, а именно скорость пролиферации и уровень апопто-за в исследуемых группах животных. Определение доли апоптических лимфоцитов проводили методом проточной цитометрии на основе индикации annexin V+ клеток (BD "Biosciences", США). Для определения скорости и индекса пролиферации было изучено распределение лимфоцитов по фазам клеточного цикла. Индекс пролиферации (ИП) вычисляли как суммарное число клеток, находящихся в S- и ^2+М)-фазах.
Основные результаты по продолжительности жизни животных-опухоленосителей рассчитывали по данным межгрупповых различий при уровне значимости P < 0,05 и P < 0,01, вычисленном по t-критерию Стьюдента. Животные были распределены на 3 группы: I - с введением цАМФ в сочетании с химиотерапией ЦФ (n = 15), II - применение только ЦФ (n = 15), III - без воздействий, контроль (n = 15).
100 150 Channels (РЕ-А)
□ Debris
□ Aggregates
■ Dip Gl
■ Dip G2
□ Dip S
1-1-1-1-1
200 250
Diploid: 100.00% Dip Gl: 81.02% at 75.97 Dip G2:0.69% at 151.94 Dip S: 18.29% G2/G1:2.00 %CV: 7.29
Total S-Phase: 18.29% Total B.A.D.: 0.00%
Debris: 0.36% Aggregates: 0.00% Modeled events: 12939 All cycle events: 12892 Cycle events per channel: 167 RCS: 3.106
Рис. 1. Гистограммы автоматического анализа распределения фаз клеточного цикла после деления (G1, G2, S) диплоидных (Dip) и анеуплоидных (An1) клеток саркомы 45 (C-45) и лимфоцитов при цАМФ-модифицированной терапии циклофосфаном: а - доминирование диплоидного типа распределения клеток С-45 у животных I группы (цАМФ+ЦФ); б - сближение частоты распределения диплоидного и анеуплоидного типов клеток С-45 у животных при введении ЦФ; в - увеличение клонов анеуплоидных клеток С-45 в контроле; г - диплоидный тип распределения в лимфоцитах крови животных с С-45. Значения каналов пика: по оси абсцисс - площадь пика, по оси ординат - ширина пика
□ Debris
□ Aggregates
■ Dip Gl
■ Dip G2
□ Dip S
■ AnlGl
□ Anl G2
□ AnlS
100 ВО Channels (PE-A)
250
Diploid: 52.68% Dip Gl: 70.49% at 47.91 Dip G2:0.00% at 95.82 Dip S: 29.51% G2/G1:2.00 %CV: 7.31
Aneuploid 1:47.32% Anl Gl: 77.92% at 76.29 Anl G2:1.43% at 152.57 Anl S: 20.65% G2/G1:2.00 %CV: 4.29 DI: 1.59
Total Aneuploid S-Phase: 20.65% Total S-Fhase: 25.32% Total B.A.D.: 0.69%
Debris: 0.00% Aggregates: 0.74% Modeled events: 17872 All cycle events: 17740 Cycle events per channel: 168 RCS: 2.889
□ Debris
□ Aggregates
■ Dip G1
■ Dip G2
□ DipS
□ AnlGl
□ Anl G2
□ Anl S
■ An2Gl
□ An2G2
□ An2S
150
Channels (PE-A)
T—I-200
250
Diploid: 39.83% Dip Gl: 2.86% at 36.06 Dip G2:0.00% at 72.12 Dip S: 97.14% G2/G1:2.00 %CV: 5.16
Aneuploid 1:32.61% Anl Gl: 94.13% at 51.54 Anl G2: 0.00% at 103.08 Anl S: 5.87% G2/G1: 2.00 %CV: 6.86 DI: 1.43
Aneuploid 2:27.56% An2 Gl: 82.42% at 82.12 An2 G2:2.36% at 164.23 An2 S: 15.22% G2/G1:2.00 %CV: 6.02 DI: 2.28
Total Aneuploid S-Phase: 10.15% Total S-Phase: 44.80% Total B.A.D.: 3.83%
Debris: 0.00% Aggregates: 4.11% Modeled events: 22061 All cycle events: 21155 Cycle events per channel: 164 RCS: 8.587
Рис. 1 (продолжение)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При изучении ДНК-цитометрических параметров опухоли установлено, что после окончания воздействий I группа животных с использованием цАМФ в сочетании с ЦФ характеризовалась наличием только диплоидных опухолевых клеток. При
таком воздействии плоидность , выражающаяся в числе хромосом (п), указывала на специфическую диплоидную (2п) кратность набора хромосом в 100% случаев, о чем свидетельствовали протоколы автоматизированного анализа (рис. 1а). Очевидность трансформирующего плоидность влияния цАМФ подтверждалась иной, характерной для
о о о
о о о
СП
и
II
CN
о о о
□ Debris
□ Aggregates
■ Dip Gl
■ Dip G2
□ DipS
50
100 150 Channels (PE-A)
200
250
Diploid: 100.00% Dip Gl: 98.48% at 49.01 Dip G2: 0.00% at 98.02 Dip S: 1.52% G2/G1: 2.00 %CV: 2.23
Total S-Phase: 1.52% Total B.A.D.: 0.31%
Debris: 0.13% Aggregates: 0.37% Modeled events: 13238 All cycle events: 13172 Cycle events per channel: 263 RCS: 2.917
Рис. 1 (окончание)
злокачественной опухоли гетерогенностью опухолевых клеток при проведении монотерапии ЦФ.
Так, во II группе частота выявления диплоидного типа клеток (52,7%) практически уравновешивалась частотой содержания анеуплоидных клеток (43,7%), которая связана с количеством патологических митозов, приводящих к неравномерному распределению хромосом между делящимися клетками (рис. 16).
Максимальное содержание анеуплоидных клеток (более 60%) наблюдалось в III (контрольной) группе животных, не подвергавшихся воздействиям. В этой гру
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.