ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ БИОЛОГИЧЕСКАЯ, 2013, № 3, с. 292-298
^=МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК 579+573.7+57.021
ОСОБЕННОСТИ ВОЗДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСНОГО ПРОБИОТИКА, СОДЕРЖАЩЕГО ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИЕ БАКТЕРИИ РОДА Cellulomonas, НА АКТИВНО РАСТУЩИХ КРОЛИКОВ
© 2013 г. Н. А. Ушакова*, К. С. Лактионов**, А. А. Козлова*, И. А. Ратникова***, Н. Н. Гаврилова***
* Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН, 119071 Москва, Ленинский просп., 33 ** Орловский государственный аграрный университет, 302019 Орел, ул. Генерала Родина, 69 ***Институт микробиологии и вирусологии МОНРК, 050010Алматы, ул. Богенбай батыра, 103
E-mail: naushakova@gmail.com Поступила в редакцию 29.06.2012 г.
Показано образование ассоциацией пробиотических бактерий родов Bacillus и Cellulomonas биопленки на поверхности частиц свекловичного жома и положительное воздействие кормовой добавки, содержащей биопленку на фитоносителе, на рост и развитие молодых кроликов. При скармливании животным комбикорма с 0.1% препарата выявлена стимуляция переваримости всех компонентов кормов, и в наибольшей степени клетчатки, увеличение биомассы симбионтных бактерий в химусе слепой кишки и увеличение ферментативной активности в этом органе. Азотный баланс сдвинут в сторону повышения содержания азота в теле животных и снижения его потерь при выведении из организма. Обсуждается механизм ответа организма кроликов на поступление в пищеварительный тракт комплексного пробиотического препарата.
DOI: 10.7868/S0002332913020161
Современное развитие концепции использования пробиотиков тесно связано с влиянием биологически активных кормовых добавок, содержащих пробиотические бактерии, на организм животного (его рост и развитие, процессы пищеварения), поскольку введением препаратов с кормами обусловливается неизбежность взаимодействия пробиотика с пищеварительной системой (Шендеров, 1998; Эе Ргйег а1., 2011; Павлов и др., 2011).
Действие пробиотиков определяется видом используемых микроорганизмов, особенностями их метаболизма, ферментативной активности и связано как с межвидовыми отношениями с членами кишечной микробиоты, так и с симбиотическими взаимодействиями с организмом-хозяином. Эффективность пробиотиков кормового назначения также зависит от типа питания животного, состава и соотношения питательных компонентов в потребляемом им корме, специфики строения пищеварительного тракта и его физиологии. Использование пробиотиков — важный прием стимуляции роста и развития животных, в том числе кроликов (Майорова, 2007).
Кролики, как и все представители зайцеобразных, по типу питания относятся к моногастрич-ным растительноядным млекопитающим. Их рацион включает в себя корнеплоды, травяную массу, а также сено, зерновые корма. Наличие в
кормах кроликов растительных компонентов, в том числе и с высоким содержанием клетчатки (таких, как сено), требует специальной бродильной камеры для их переваривания, роль которой играет слепая кишка — основное место деградации лигнина, пектина и целлюлозных волокон. Линейный размер слепой кишки у этих животных составляет в среднем 12% общей длины кишечника (Наумова, 1981). Ее максимальный объем у взрослых кроликов средней массой 5 кг достигает 500 мл (для сравнения объем желудка составляет 180-200 мл (Калугин, 1980; Лактионов, 2008)). Все это свидетельствует о значительной функциональной роли данной структуры толстого отдела кишечника зайцеобразных.
Относительно большие размеры слепой кишки позволяют получить кроликов с фистулой этого органа. Применение фистульной методики дает возможность в ходе хронического эксперимента наблюдать за функцией слепой кишки, оценить отдельные показатели пищеварения непосредственно в химусе, и в том числе получить доказательство влияни пробиотических препаратов кормового назначения на пищеварение.
Последнее связано с направленным конструированием комплексного пробиотического препарата нового поколения, в котором клетки бактерий образуют биопленку на твердом носителе (Ушакова и др., 2010). Для пробиотических пре-
паратов важна устойчивость клеток к действию неблагоприятных факторов окружающей среды, поэтому получение биопленки пробиотиков способствует защите вегетативных клеток при высушивании, грануляции, а также в кислых условиях желудка.
Основа препарата — штамм Bacillus subtilis B-8130, обладающий нейтральной протеазой, а также эндоглюканазной активностью (Ушакова и др., 2006), позволяющей микроорганизму участвовать в процессах гидролиза протеинов и начальных этапах расщепления целлюлозы. В составе про-биотической композиции биологическая эффективность бациллы усилена целлюлолитическими бактериями Cellulomonas uda АТСС 491, которые характеризуются наличием целлюлазы и способностью синтезировать аминокислоты (Srinivasan, Choi, 1981). Ранее было показано, что бактерии рода Cellulomonas могут входить в состав пробиотиче-ского препарата для животных (Гаврилова и др., 1991). Это стало основанием для комбинирования бациллы с целлюломонасом. Предположено, что опытный препарат с протеолитическими и целлю-лолитическими бактериями будет стимулировать переваримость белков и клетчатки кормов у кроликов как представителей зайцеобразных.
Цель работы — получение биопленки пробиотиков B. subtilis В-8130 и C. uda АТСС 491 на фито-носителе и изучение влияния опытного препарата на организм молодого интенсивно растущего кролика.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пробиотический препарат получали путем твердофазного культивирования бациллы B. subtilis В-8130 (Ушакова и др., 2009) совместно с целлюломонасом C. uda АТСС 491 на свекловичном жоме при 37° С в течение 3 сут при начальной влажности ферментационной массы 50 ± 5%.
Число клеток пробиотиков в препарате определяли путем высева на мясопептонный агар последовательных десятикратных разведений суспензии 1 г препарата в 99 мл физраствора после встряхивания на вортексе V-3 (ELMI, Sky Line, Латвия). Оценивали суммарное число колоний, а также неокрашенных колоний бациллы и желтых — целлюломонаса.
Состояние клеток бактерий контролировали микроскопией окрашенных генцианвиолетом фиксированных препаратов с использованием светового микроскопа Axioskop с компьютерной системой анализа изображения KS 300 (Zeiss, Германия). Биопленку на фитоносителе исследовали методом сканирующей электронной микроскопии. Электронную микроскопию осуществляли с помощью сканирующего электронного микроскопа CamScan МВ 2300 (Чехия). Ферментацион-
ную массу насыпали в каплю изотонического (0.5 М) раствора сахарозы на поверхности покровного стекла (S = 18 х 18 мм2), высушивали на воздухе при комнатной температуре в течение 1 сут. Нижнюю часть стекла прикрепляли с помощью двусторонней проводящей углеродной ленты к поверхности манипуляционного столика. Препарат напыляли золотом под вакуумом согласно стандартной процедуре приготовления препаратов для электронной сканирующей микроскопии.
Воздействие кормового пробиотического препарата на организм кролика исследовали в специальном эксперименте. В условиях вивария были сформированы две группы (по пять особей в каждой группе) кроликов-аналогов породы калифорнийская белая с фистулой слепой кишки — контрольная и опытная. Кормление контрольной группы осуществляли гранулированным комбикормом № 343 для сельскохозяйственных животных, обогащенным введением 10% по массе подсолнечного жмыха и 2.5% мясокостной муки. В рационе опытной группы использовали такой же обогащенный комбикорм, как и для контрольной группы, но с добавлением пробиотического препарата (1 кг/т). Кроликов содержали в одинаковых условиях в сетчатых клетках, кормили и поили без ограничений. Температура воздуха колебалась от 18.5 до 20.3°С. Продолжительность опыта — 30 сут; эксперимент проводили в период активного роста животных с 90- до 120-суточного возраста.
Все кролики были прооперированы в возрасте 90 сут. Операция заключалась во вживлении в слепую кишку пластиковой канюли, позволяющей отбирать химус этой кишки. У крольчат в возрасте 120 сут были отобраны пробы (по 5 г) химуса (дважды за сутки — в 9:00 и 16:00), и в полученных пробах сразу же определяли ферменты, численность микроорганизмов и метаболиты по традиционным методикам (Лактионов, 2008; 2009): активность амилазы регистрировали фотометрически методом Асатиани; протеаз — методом Мура и Стейна в модификации Уголева, основанным на учете количества освобожденных при гидролизе казеина L-аминокислот по реакции с нингидрином; уреазы — методом Самнеруа и Соммерса с последующим определением аммиака способом Рассела; целлюлазы — оригинальным методом в условиях in vivo; липазы — титро-метрическим методом Альтгаузена.
Переваримость кормов определяли у крольчат в возрасте 95—97 сут стандартными методами, а показатели переваримости клетчатки — по убыли массы обеззоленного фильтра, помещенного в капсулу с продольной перфорацией непосредственно в слепую кишку (экспозиция — 12 ч) (Лактионов, 2008; 2009). Переваримость питательных веществ определяли в течение 3 сут (по
Таблица 1. Изменение живой массы и среднесуточных приростов крольчат с 90-х по 120-е сут опыта
Группа Средняя живая масса (M t m), кг Среднесуточный прирост
начало опыта конец опыта % (M ± m), г %
Контрольная 2.28 ± 1.36 2.98 ± 0.23 100.0 23.4 ± 2.07 100.0
Опытная 2.25 ± 0.10 3.07 ± 0.42 103.0 27.4 ± 2.34 117.1
15 проб от каждой группы животных), показатели в слепой кишке — в течение 1 сут (всего по 10 проб от опытной и от контрольной групп кроликов). Достоверность результатов оценивали по ¿-критерию Стьюдента; для построения графиков применяли программу OriginPro 8.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Полученный опытный пробиотический препарат содержал (10 ± 4.7) х 108 КОЕ/г клеток про-биотиков, в том числе (17 ± 1.9) х 107 КОЕ/г клеток B. subtilis B-8130 и (80.5 ± 6.6) х 107 КОЕ/г клеток C. uda АТСС 491. Световая микроскопия показала соответствие морфологии клеток типовым описаниям: оба штамма — клетки бациллярной формы. Представители B. subtilis — спорооб-разующие бациллы, бактерии рода Cellulomonas — палочки, прямые или изогнутые, иногда располагающиеся под углом одна к другой, что соответствует морфологии корин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.