ГЕНЕТИКА, 2007, том 43, № 11, с. 1501-1510
^ ГЕНЕТИКА ^^^^^^^^^^^^^^^^
РАСТЕНИЙ
УДК 557.11.113:579.254.26:633.71:633.4
ОСОБЕННОСТИ ВСТРАИВАНИЯ ВЕКТОРНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ В ГЕНОМ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ
© 2007 г. Н. В. Пермякова (Пухначева), Е. В. Дейнеко, В. К. Шумный
Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090;
факс: (383) 333-12-78; e-mail: puh@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 14.02.2007 г.
Показано, что при процессинге Т-ДНК обе краевые границы могут определяться неправильно. Был выявлен ряд трансгенных растений, содержащих кроме фрагмента векторной ДНК, прилежащего к левой границе Т-ДНК, еще и фрагмент вектора, встроившийся независимо от нее. С помощью се-квенирования подтверждены перенос и встраивание в геном трансгенных растений генов, находящихся за пределами Т-ДНК. Выявлена рекомбинация векторной ДНК среди растений первого поколения от самоопыления исходных трансформантов.
Известно, что при создании трансгенных растений методом агробактериального переноса в растительный геном могут быть встроены фрагменты векторной ДНК [1-5]. Такие встройки являются результатом ошибок процессинга Т-ДНК в клетке агробактерии и, как следствие, неправильного определения краевых повторов [2-7].
В настоящее время существуют две гипотезы, объясняющие возможный механизм переноса векторных последовательностей. Первая заключается в том, что при процессинге Т-ДНК пропускается левый концевой повтор, и вслед за Т-ДНК реплицируется векторная последовательность [3, 8, 9]. Согласно второй гипотезе, левый концевой повтор неправильно опознается (как правый), и репликация ДНК начинается с него, проходит всю векторную последовательность, затем, минуя правый концевой повтор, проходит всю Т-ДНК и оканчивается на левом концевом повторе [10, 11].
Векторные последовательности могут переноситься в геном трансгенных растений вместе с Т-ДНК, а также независимо от нее [1-3]. Как установлено нами ранее, среди 125 независимо полученных трансформантов табака и моркови у 35.2% растений в геноме обнаруживались фрагменты векторных ДНК. Из них в 16% случаев составлял перенос фрагментов вектора, прилежащих к тому или иному краевому повтору Т-ДНК, 3.2% растений несли средний фрагмент плазмид-ной последовательности, встроившийся в геном растения независимо от Т-ДНК [5].
Выявление фрагментов векторных ДНК, прилежащих к правой и левой границам Т-ДНК, вполне согласуется с вышеупомянутыми гипотезами, предполагающими тот или иной механизм их образования. Остается не совсем ясным, как возникают обнаруживаемые нами в геноме отдельных трансгенных растений векторные фраг-
менты, не связанные с областью Т-ДНК, и как организованы встройки, несущие более одного фрагмента векторной ДНК? В связи с этим цель нашей работы - выявление и анализ особенностей встраивания не связанных между собой, а также и с Т-ДНК векторных последовательностей в трансгенных растениях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В качестве исходного материала было использовано 118 трансгенных (Т0) растений табака, содержащих маркерные гены неомицинфосфо-трансферазы (прШ) и в-глюкуронидазы (uidA), и моркови, содержащей маркерный ген прЖ и целевой ген интерлейкина-18 человека [12, 13]. Растения были получены стандартным методом агро-бактериальной трансформации [14]. Растительную ДНК выделяли стандартным методом [14].
Для детального анализа схемы встраивания векторных фрагментов в геном трансгенных растений при помощи программы О^о был сконструирован ряд праймеров на векторные последовательности. Схема расположения всех типов праймеров приведена на рис. 1. Так как праймеры BD1/2, BD3/4, BD5/6 были использованы нами ранее [5], мы считаем целесообразным указать лишь расположение определяемых ими фрагментов относительно вп репликации плазмиды рВП21. Фрагмент BD1/2 начинается с позиции 1809, фрагмент BD3/4 - с позиции 8698 пн, фрагмент BD5/6 - с позиции 11494 пн относительно вп репликации плазмиды рВП21.
Праймеры на фрагмент векторной ДНК, находящийся в середине векторной последовательности, ближе к правому концевому повтору Т-ДНК (фрагмент BD7/8 начинается с позиции 13867 пн относительно вп репликации плазмиды рВП21):
Рис. 1. Схема расположения праймеров в конструкции, использованной для создания трансгенных растений на основе плазмиды pBi121. Область Т-ДНК выделена светло-серым цветом. Обозначения: nptII - ген неомицинфосфотрансфе-разы II E. coli; uidA - ген ß-глюкоронидазы E. coli; LB, RB - повторы, окаймляющие Т-ДНК; 0 - ori репликации; BD1/2, BD3/4, BD5/6, BD7/8, BD9/10 - праймеры на векторные последовательности; BD1.1, BD3.1, pbi1-pbi8 - праймеры для секвенирования; npt1/2 - праймеры на ген неомицинфосфотрансферазы II E. coli.
BD7 5'-CGCCATGAAGTCCGTGAATG-3' и BD8 5'-AGTTATGCCGTCCCGTGAAT-3', размер фрагмента 562 пн. Праймеры на фрагмент векторной ДНК, находящийся в середине векторной последовательности, ближе к левому концевому повтору Т-ДНК (фрагмент BD9/10 начинается с позиции 661 пн относительно ori репликации плазмиды pBi121): BD9 5'-CTGACGCCGTTGGATACAC-3' и BD10 5'-TAATGGCGGAAACTCACTCG-3', размер фрагмента 419 пн. Одновременно в реакциях амплификации участвовали следующие типы праймеров - на ген nptII: npt1 5'-CGACGTTGT-CACTGAAGCG-3' и npt2 5'-AAGCACGAG-GAAGCGGTCAG-3' с размером фрагмента 487 пн; на хозяйский ген NtGA2 табака: NtGA1 5'-ACAGTTGCCCTTGCTTATCGC-3' и NtGA2 5'-TTCAACACGAACGGAACAGAC-3' с размером фрагмента 609 пн; на хозяйский ген экстенсина моркови: car1 5'-ACCTCCTCCTCCTCACCAC-TAC-3' и car2 5'-TAAGTTGGCCTCCATCAGT-GTC-3' c размером фрагмента 249 пн.
Правый и левый краевые повторы Т-ДНК в плазмиде pBi121 находятся в позициях 2454-2478 и 8621-8646 пн соответственно.
Реакционная смесь для амплификации объемом 20 мкл содержала: 60 мМ трис-HCl (pH 8.5), 1.5 мМ MgCl2, 25 мМ KCl, 10 мМ 2 меркаптоэта-нола, 0.1% титон Х-100, 0.2 мМ каждого dNTP, по 0.25 пМ праймера на векторную ДНК, по 0.12 пМ
праймеров на ДНК табака пли моркови соответственно, по 0.12 пМ праймера на ген неомицинфосфотрансферазы, 2 ед. термостабильной Taq-ДнК-полимеразы ("СибЭнзим", Новосибирск), 30 нг выделенной ДНК. Амплификация осуществлялась в следующем режиме: денатурация 3 мин при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 60°С, элонгация 1 мин при 72°С для первых трех циклов, затем денатурация 30 с при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 62°С, элонгация 1 мин при 72°С для последующих 32 циклов. Все амплификации проводились в программируемом амплификаторе "Терцик" фирмы "ДНК Технология" (Россия).
Для того чтобы исключить присутствие в анализируемых образцах почвенной бактерии А. Шше-/аает, дополнительно использовали праймеры на фрагмент ДНК А. Шше/аает: Ах 5'-САТ-GATCGGCCGGCTGACA-3', А2 5'-TGCGCAG-GTCGCTШCГГTC-3' с размером фрагмента 277 пн. Реакционная смесь объемом 15 мкл имела состав, аналогичный составу, описанному для ПЦР с праймерами на векторные последовательности. Амплификация осуществлялась в следующем режиме: 1 цикл денатурация 3 мин при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 64°С, элонгация 1 мин при 72°С, следующие три цикла: денатурация 40 с при 95°С, отжиг праймеров 30 с при 64°С, элонгация 1 мин при 72°С и затем денатурация 40 с при 95°С,
отжиг праймеров 30 с при 62°С, элонгация 1 мин при 72°С для последующих 28 циклов.
Для уточнения взаиморасположения фрагментов векторной ДНК относительно Т-ДНК у растения табака 16.83, несущего две не сцепленные между собой плазмидные последовательности, и у растения моркови 106, несущего неопределенное количество копий Т-ДНК, участки векторной ДНК были секвенированны.
Клонирование и секвенирование фрагментов векторной ДНК проводили методом "инвертированной" ПЦР [15]. Праймеры, использованные для секвенирования: BD1.1 5'-TAACGCG-CAAGTTTTCAGCG-3', BD3.1 5'-TGGCGTAAT-AGCGAAGAGGC-3' , pbi1 5'-GACCTGCAGTCT-CATATTCACTCTCAATCC-3', pbi2 5'-GATG-GATCCATAAATTCCCCTCGGTATCCA-3', pbi3 5'-GACCTGCAGTCGTTTCCCGCCTTCAGT-3', pbi4 5'-GATGGATCCTTAATTCTCCGCTCATGATC-3', pbi5 5'-GACGGATCCACTACGTGAACCATCAC-3', pbi6 5'-CACGGATCCGTCTATCAGGGCGATGG-3', pbi7 5'-GACGGATCCAACGTCCGCAATGTGTTAT-TAAG-3', pbi8 5'-CACAAGCTTGCCCGTCTCACTG-GTGA-3 (см. рис. 1).
Для секвенирования геномную ДНК трансгенных растений табака и моркови (100-200 нг) гидро-лизовали эндонуклеазами рестрикции TaqI, MspI, Bsp19I или EcoRI, смесь экстрагировали фенолом. ДНК растворяли в лигазном буфере (1-2 нг/мкл) и подвергали самолигированию в течение ночи при температуре 8°C. ДНК осаждали этанолом, растворяли в воде и использовали в качестве матрицы для ПЦР с указанными выше праймерами. ПЦР проводили в 50 мкл буфера, содержащего 67 мМ трис-HCl (pH 8.9), 16 мМ (NH4)2SO4, 1.5 мМ MgCl2, 0.01% твин-20, 10 мМ ß-меркаптоэтанола, 100 мкМ dNTP, 1 мкМ праймеров, 2 ед.акт. Taq-ДНК-полимеразы. Амплификацию осуществляли в течение 32 циклов в следующем режиме: денатурация - 1 мин при 94°С, отжиг праймеров 1 мин при 52°С для первого цикла и 30 с при 62°С для всех последующих циклов, элонгация 3 мин при 72°С. Далее 1/10 амплификационных смесей использовали для второго раунда амплификации с "внутренними" праймерами в аналогичных условиях ПЦР. Нуклеотидные последовательности клонированных фрагментов ДНК определяли с использованием "ABI PRISM Big Dye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit" ("Amer-sham", UK) в Межинститутском центре секвенирования (ИХБиФМ СО РАН). Полученные с помощью секвенирования последовательности ДНК были проанализированы методом BLAST по базе данных GenBank. О степени сходства (различия) состава нуклеотидных последовательностей фрагментов, прилежащих к одному и тому же краевому повтору, для растения 16.83 судили на основании
-4
Рис. 2. Филограмма, показывающая родство секвени-рованных участков ДНК, прилежащих к левой границе Т-ДНК, выделенных из растения табака 16.83. Цифрами 1, 2, 3 и 4 обозначены последовательности ДНК.
филограммы (рис. 2), построенной при помощи программы ClustalW.
Для уточнения количества копий Т-ДНК, встроившихся в геном трансгенных растений, геномная ДНК растений табака 16.83, 121.83, 121.86 и Res79 была проанализирована методом Саузерн-блот. Для этого из ук
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.