МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2004, том 38, № 2, с. 179-190
К 100-ЛЕТИЮ СО ДНЯ РОЖДЕНИЯ A.A. БАЕВА ОНКОГЕНОМИКА
УДК 575:599.9
Посвящается светлой памяти основателей отечественной программы "Геном человека" академиков А.А. Баева и А.Д. Мирзабекова
ОТ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОМНОГО ПОЛИМОРФИЗМА К ДИАГНОСТИЧЕСКИМ И ПРОГНОСТИЧЕСКИМ МАРКЕРАМ ЭПИТЕЛИАЛЬНЫХ ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА
© 2004 г. Э. А. Брага1, Л. Л. Киселев2, Е. Р. Забаровский23
Государственный научный центр Российской Федерации "ГосНИИгенетика", Москва, 117545 2Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгелъгардта Российской академии наук, Москва, 119991 3Microbiology and Tumor Biology Center, Karolinska Institute, Stockholm, 17177, Sweden
Поступила в редакцию 15.08.2003 г.
Представлены результаты нескольких исследовательских групп по следующим направлениям: 1) идентификация полиморфных локусов в геноме человека; 2) локализация и анализ генов, связанных с эпителиальными опухолями разных локализаций; 3) разработка молекулярных маркеров социально значимых онкологических заболеваний. Работы по первым двум направлениям инициированы и выполнялись в значительной мере при поддержке Российской национальной программы "Геном человека". Для выявления новых полиморфных локусов в геноме человека проведен анализ ди-, три- и тетрануклеотидных тандемных повторов в составе космид упорядоченной клонотеки хромосомы 13, №?Я-клонов и космид, локализованных на хромосоме 3, а также в составе коллекций EST мозга. Суммарно идентифицировано девять полиморфных и до 200 STS-маркеров. Маркеры в ^oíI-клонах хромосомы 3 связаны с генами; полиморфные локусы (NL1-024, NL2-007 и EST04896) использованы при поиске делеций в области 3p в ДНК опухолей. С помощью делеционного картирования 3p в эпителиальных опухолях пяти локализаций определено шесть критичных участков, потенциально содержащих TSG: два участка - в дистальном районе 3p и четыре участка - в области 3p21.3. Установлена значимая корреляция частоты аллельных делеций со стадией и степенью анапла-зии опухолей (P < 0.05). Согласно этим данным, гены из области 3p связаны не только с возникновением, но и с прогрессией опухолей, и могут быть использованы в качестве прогностических маркеров. Показано, что в районах LUCA и AP20 из области 3p21.3 наблюдается высокая частота (90%) аберраций, в том числе до 20% гомозиготных делеций. Пик аллельных делеций в районе D3S2409-D3S3667 (600 т.п.н.) статистически достоверен (P = 10-3). Районы AP20 и D3S2409-D3S3667 (3p21.3) определены нами впервые. В районах LUCA, AP20 и D3S2409-D3S3667 (3p21.3) идентифицированы кластеры генов-супрессоров. Важно, что метилирование TSG 3p RASSF1A и RAR-beta2 - ранние события в канцерогенезе, а SEMA3B связано с прогрессией опухолей, что можно использовать как для ранней диагностики, так и для послеоперационного прогноза течения заболевания.
Ключевые слова: хромосомы 3 и 13 человека, полиморфные и STS-маркеры, эпителиальные опухоли, 3p-делеции, метилирование, гены-супрессоры, прогрессия опухолей, диагностические и прогностические маркеры опухолей.
Принятые сокращения: AP20 - область локализации клона 20 Alu-PCR; EST - экспрессирующиеся нуклеотидные последовательности; FISH - флуоресцентная гибридизация in situ; HD - гомозиготная делеция; LOH - потеря гетерози-готности; LUCA - область генов, связанных с раком легкого (Lung Cancer); p - короткое плечо хромосомы; q - длинное плечо хромосомы; рДНК - нуклеотидные последовательности генов рибосомных РНК; SAGE - серийный анализ экспрессии генов; STS - участки, идентифицируемые по нуклеотидным последовательностям; TSG - гены-супрессоры опухолевого роста; YAC - искусственная хромосома дрожжей.
*Эл. почта: ebraga@genetika.ru; Eugene.Zabarovsky@mtc.ki.se
МИКРОСАТЕЛЛИТНЫЕ МАРКЕРЫ НА ХРОМОСОМАХ 3 И 13 И В СОСТАВЕ ГЕНОВ, ЭКСПРЕССИРУЕМЫХ В МОЗГЕ
При картировании отдельных хромосом человека и генома в целом важную роль сыграли полиморфные и БТБ-маркеры. Для идентификации полиморфных генетических маркеров наиболее эффективными справедливо признаны микросателлиты - короткие тандемные повторы от 2 до 6 н.п. Если участки ДНК, окружающие повторы микросателлитов, имеют единственную локали-
зацию (уникальны) в геноме человека, то такие локусы могут быть идентифицированы с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР). Высокополиморфные маркеры, локализованные на генетической карте друг относительно друга с помощью анализа сцепления, были использованы при построении и стыковке УАС-контигов генома человека. Неполиморфные БТБ-маркеры, охарактеризованные по их нуклеотидной последовательности, условиям их идентификации ПЦР и по локализации на хромосоме, также широко применяли при построении физических карт как на основе соматических и радиационных гибридов, так и на основе перекрывающихся клонов (кос-мид, .оЯ-связующих, .оЯ-прыжковых и УАС-клонов). Полиморфные маркеры, кроме полногеномного картирования, использованы для локализации генов наследственных заболеваний и других генетических повреждений, например, связанных с возникновением опухолей.
Объектами отечественной программы "Геном человека" конца 80-х гг. - начала 90-х гг. были в основном хромосомы 3, 13 и 19. Что касается хромосомы 3, то выявлена ее связь с образованием эпителиальных опухолей. Короткое плечо этой хромосомы с наибольшей частотой подвержено делециям при раке почки и легкого, а также в эпителиальных опухолях многих других локализаций [1]. Кроме того, определенные фрагменты 3р-плеча проявляют способность подавления опухолевого роста. В случае хромосомы 13 показано, что длинное плечо 13q ассоциировано с ретиноб-ластомой, болезнью Вильсона, альвеолярной рабдомиосаркомой, аутосомной рецессивной мышечной дистрофией и другими генетическими заболеваниями (см. [2]). В области 13q12 удалось локализовать второй ген, ассоциированный с развитием рака молочной железы, BRCA2. Предстояло локализовать ген лимфоцитарного лейкоза.
К 1994 г. генетическая карта генома человека третьего поколения содержала около двух тысяч полиморфных СА-повторов, из которых 60% уникальны на хромосомных картах [3]. Ряд авторских коллективов ИМБ РАН, ИОГен РАН и ГосНИИгенетики в рамках Программы "Геном человека" объединили свои усилия для идентификации три- и тетрануклеотидных микросателлитов на хромосомах 3 и 13. Увеличение длины звена повышает разрешающую способность при анализе аллельного полиморфизма и достоверность результатов, а также позволяет перейти от радиоактивного мечения к окрашиванию фрагментов ДНК серебром. В связи с этим, использование в качестве маркеров локусов три- и тетрамер-ных повторов имеет преимущество и при их внедрении в клиническую практику с целью диагностики, и для прогноза генетических заболеваний.
Российским исследователям зарубежными коллегами были предоставлены две упорядоченные космидные клонотеки хромосомы 13 (C108 DH5 L4/FS13, ICRF, UK и LA13NC01, LANL, USA). С другой стороны, к 1994 г. были созданы NotI-связующие и NotI-прыжковые клонотеки хромосомы 3 человека [4-6], в составе ДНК NotI-клонов идентифицированы гены и проводились работы по локализации отдельных клонов на хромосоме методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) [7-9].
Микросателлиты на хромосоме 13
Созданию полиморфных маркеров предшествовал этап по выявлению локусов ди-, три- и тетрануклеотидных тандемных повторов в составе клонов этих хромосом. Была проведена гибридизация панелей высокой плотности клонотеки хромосомы 13 ICRF (12000 клонов) с олигонукле-отидными зондами на повторы разных мотивов. Эти исследования обнаружили интересные закономерности в распределении микросателлитов [10]. Так, оказалось, что для короткого плеча хромосомы 13, которое состоит главным образом из семейства средне-повторяющихся генов рибо-сомных РНК (рДНК), характерны кластеры из микросателлитов нескольких типов, например (GACA)„, (GACT)n, (TCC)n, (CAC)„ и (GA)„. Микросателлиты в составе более крупных повторов рДНК на плече 13p a priori не подходили на роль уникальных маркеров. Напротив, на длинном плече этой хромосомы наиболее представлены повторы GATG, не характерные для рДНК. Более 20 космид, содержащих GATG-повторы, локализованы на плече 13q методом FISH и использованы для создания маркеров [2, 11]. Реклонирование этих космид позволило определить 45 нуклеотид-ных последовательностей по 300-900 п.н., охватывающих суммарно более 22 т.п.н. (EMBL: Z73328-Z73335; Z73915-Z73930). Локусы микросателлитов обнаружены в составе 14 нуклеотидных последовательностей. Многие локусы, кроме GATG-повторов, содержат включения из тетра-нуклеотидов других мотивов, например GAGG, GACG, GACA, GATA. Один из таких мозаичных локусов содержат 45 звеньев GATG и 41 вырожденных. Общее число повторов варьирует от 7 до 86. Для семи наиболее протяженных локусов подобраны праймеры и условия ПЦР. Четыре маркера оказались высокополиморфными (см. таблицу), а другие представляют собой STS-маркеры [2, 12].
Так как появилось сообщение о возможной ассоциации области 13q14.1-q32 с шизофренией [13], мы провели сравнительный анализ аллельного полиморфизма GATG-локуса из района 13q14 (космида 19D05) в подгруппах больных шизофренией (38 человек), шизоаффективным пси-
Характеристика некоторых полиморфных маркеров генома человека (суммировано по данным работ [2, 10-12, 15, 20])
Обозначение клона Гомология c геном или EST Локализация на хромосоме Структура повтора микросателлитного локуса Интервал размеров ПЦР-продук-тов (п.н.) Число аллелей/гете-розиготность/число генотипов
29B02* - 13q12-13# (GATG)15/26 139-151 4/0.63/10
19D05* - 13q14## (GATG)24/50 208-224 5/0.64/15
59E09* - 13q32-33# (GATG)49/83 344-364 6/0.75/15
75D06* - 13q34# (GATG)43/86 436-448 4/0.68/10
EST06822 - Хром. 1§ (CAG)14 169-184 5/0.46/9
EST02676 KIAA0027 22q13.3§§ (CTG)19 303-321 7/0.83/25
EST04896 Рибосомный белок L14 3p21§ (CAG)17 138-153 8/0.76/27
NL1-024** кДНК—3' AA405005, AA700946 3p22-p21.33#§§ (CA)27 140-150 6/0.64/15
NL 2-007** KIAA0116 ZDHHC3 3p21.32-p21.31# (GT/GA)29 или (GT)16(GA)13 154-162 5/0.46/9
* Космиды упорядоченной клонотеки хромосомы 13, ICRF (12000 клонов). ** Клоны из ^оЯ-связую
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.