ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2008, том 418, № 4, с. 553-556
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.353.2:615.831
ОТКРЫТИЕ АМИЛОИДНЫХ САРКОМЕРНЫХ БЕЛКОВ В СЕМЕЙСТВЕ ТАЙТИНА
© 2008 г. 3. А. Подлубная, Л. Г. Марсагишвили, член-корреспондент РАН Л. М. Чайлахян
Поступило 27.09.2007 г.
Амилоидозы - большая группа конформаци-онных заболеваний, которая характеризуется неограниченно растущими белковыми отложениями в виде нерастворимых фибрилл (амилоидов) в разных органах и тканях, образующихся в результате наследственного или приобретенного нарушения сворачивания белков [1, 2]. Их накопление нарушает структуру и функционирование органов и тканей, приводя к летальному исходу. Амилоиды играют центральную роль в патогенезе болезней, от которых страдают миллионы пациентов (болезнь Альцгеймера, Паркинсона, второй тип диабета, синдром Дауна и др.) [1, 3, 4]. Уже сейчас эти болезни - главная причина смерти после сердечно-сосудистых и онкологических заболеваний. Диагностика большинства из них посмертная. Изучение амилоидозов приобрело особую актуальность и в связи с распространением прионных болезней (прионных амилоидозов), таких, как смертельные энцефалопатии у людей (болезнь Куру, Крейтцфельда-Якоба, Хинтинг-тона и др.), а также энцефалопатии у животных и птиц (бешенство коров, скрепи овец и др.) [5]. Молекулярные механизмы амилоидозов, включая прионные, до конца не выяснены. Известно около 20 белков, образующих амилоидные фибриллы и участвующих в патогенезе амилоидозов [2, 6]. Несмотря на различие в белках-предшественниках амилоидов, их амилоидные фибриллы имеют общие свойства: Р-складчатую структуру с отдельными Р-слоями, ориентированными параллельно главной оси фибриллы; нерастворимость in vivo; специфическое связывание с красителями конго красным и тиофлавином Т [7, 8]. Поэтому a-спиральные белки-предшественники амилоидов должны претерпевать трансформацию типа "a-спираль - Р-складчатость", необходимую для образования амилоидных фибрилл [7, 8]. Процессы, лежащие в основе аномальной агрегации белка и ее патологического проявления
при болезнях, изучены недостаточно. Выяснение молекулярных механизмов амилоидозов, установление белковой природы депозитов, предупреждение амилоидозов или их выявление на ранних стадиях и назначение своевременного, эффективного лечения продолжают оставаться актуальными задачами современной медицины. Успешное решение этих задач во многом зависит от фундаментальных знаний амилоидогенеза: выяснения свойств амилоидов разных белков, знания факторов, регулирующих их образование и разрушение, их эффектов на жизнедеятельность разных клеток и т.д. В наибольшей мере это относится к мышечным амилоидозам как наименее изученным. Амилоидные отложения были найдены уже давно в сердце, скелетных мышцах и кровеносных сосудах при кардиомиопатиях, миокардитах и миозитах [9], но их белковая природа оставалась неизвестной. Нами впервые проведено тестирование мышечных белков на амилоидогенность, что привело к открытию новых белков-предшественников амилоидов - саркомерных белков семейства тайтина (тайтина, С-, Х- и Н-белков). В саркомере эти белки связаны с миозиновыми нитями и составляют 15% от общего количества белка после миозина (~40%) и актина (~20%). Наличие 90% исходной Р-складчатой структуры в этих белках и сходство агрегатов Х-белка с амилоидными фибриллами, образуемыми АР-пептидом в мозге при болезни Альцгеймера [10], стимулировали наше исследование возможной амилоидной природы агрегатов, образуемых Х-белком и другими сар-комерными белками семейства тайтина. Все используемые нами методы подробно описаны в работе [11]. С помощью электронной микроскопии в широком диапазоне условий диализа (30 мМ КС1, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.0; 0.15 М глицин-КОН, рН 7.5; 2550 мМ КаС1, 10 мМ Нереэ, рН 7.0; 30-50 мМ М§С12, 10 мМ имидазола, рН 7.0; 30 мМ СаС12, 10 мМ имидазола, рН 7.0; при 4 и 37°С) исследуемые белки скелетных и сердечных мышц кролика и человека формировали полиморфные агрегаты, сходные с амилоидами АР-пептида, найденными в мозге при болезни Альцгеймера: аморфные агре-
Институт теоретической и экспериментальной биофизики Российской Академии наук, Пущино Московской области
гаты, протофибриллы, линейные и спиральные фибриллы, спиральные ленты и пучки фибрилл. Амилоидная природа агрегатов, образуемых белками семейства тайтина, была доказана стандартными тестами на амилоиды с использованием конго красного и тиофлавина Т [7, 8]. Эти красители используются и в клинической практике для определения амилоидных отложений in vivo, и для исследования амилоидогенеза in vitro. При окрашивании конго красным фибриллярных структур, формируемых исследуемыми белками, наблюдается двойное лучепреломление в поляризационном микроскопе, а при окрашивании их тиофлави-ном Т - флуоресценция в люминесцентном микроскопе. При спектральных исследованиях интенсивность флуоресценции тиофлавина Т в присутствии фибрилл X-, Н-, С-белков и тайтина возрастала в ~10, ~9, ~7 и ~5 раз по сравнению с интенсивностью флуоресценции красителя в присутствии этих белков в молекулярной форме. При измерении спектральных характеристик конго красного в присутствии фибрилл тайтина, X-, С- и Н-белков наблюдался сдвиг его спектра поглощения в длинноволновую область от ~490 к ~500 нм. Эти изменения свидетельствуют о связывании тиофлавина Т и конго красного с амилоидными фибриллами [7, 8].
Наши исследования были направлены также на тестирование токсических свойств амилоидов этих белков, на поиск подходов к их разрушению и предотвращению их образования. С помощью электронной микроскопии мы показали, что антибиотик тетрациклин, добавленный к амилоидам X-белка (спирально скрученным лентам) в массовом отношении 1 : 1, разрушает их на мелкие фрагменты и отдельные молекулы. Действие тетрациклина подобно его действию на амилоиды АР-пептида и тау-белка при болезни Альцгей-мера, на депозиты хантингтина при болезни Хантингтона, а также на амилоидные фибриллы при-онного белка [12]. Методом электронной микроскопии мы впервые продемонстрировали также сходную антиамилоидогенную способность гидратированного фуллерена С60 по отношению к фибриллам АР(25-35)-пептида и Х-белка. Добавление фуллерена С60 к амилоидам Х-белка в массовом соотношении 1 : 2 приводило к их декорации сферическими агрегатами фуллерена, уменьшению длины и ширины лент и их количества. Более того, в присутствии фуллерена Х-белок в молекулярной форме не формировал амилоидных фибрилл. Такое же действие оказывал фул-лерен С60 на амилоиды АР(25-35)-пептида, добавленный в молярном отношении 1 : 6. Увеличение количества фуллерена, добавленного к амилоидам АР(25-35)-пептида до молярного отношения 15 : 6, приводит к усилению его эффекта. Заметим, что фуллерен так же, как и тетрациклин, не
только разрушает зрелые амилоиды, но и предотвращает рост новых амилоидов АР(25-35)-пепти-да и Х-белка. Полученные результаты подтверждают наше предположение о возможности сходных подходов к разрушению амилоидов, образованных разными белками, в связи с их сходными физико-химическими свойствами. Эти подходы могут быть разработаны с использованием удобных систем саркомерных цитоскелет-ных белков семейства тайтина.
Недавно мы показали, что введение в мозг крысам фуллерена С60 положительно влияет на когнитивные процессы в норме [13]. Этот результат свидетельствует об отсутствии нейротоксич-ности фуллерена С60. Более того, имеется соответствие между антиамилоидогенным действием фуллерена С60 in vitro и его способностью предотвращать нарушение решения когнитивных вероятностных задач у экспериментальных животных, индуцированное АР(25-35)-пептидом. В последнее время фуллерены рассматривают как потенциальные лекарственные препараты, в том числе и при лечении нейродегенеративных болезней [14]. Наши данные также позволяют рассматривать фуллерены С60 как потенциальные лекарства при лечении амилоидозов. Заметим, что антиамилоидо-генная активность фуллеренов, наноразмерных частиц диаметром ~0.71 нм, открывает перспективы для разработки новой медицинской нанотехноло-гии для терапии амилоидозов, и в частности, болезни Альцгеймера.
Токсичность амилоидов мышечных белков была исследована in vitro на актомиозиновой системе. Можно полагать, что образование амилоидных фибрилл белками семейства тайтина в мышечной клетке и их накопление будет влиять на сократительную способность мышцы и ее основного белка миозина. Тестирование влияния исследуемых белков в молекулярной форме и их амилоидных фибрилл на АТФазную активность ак-томиозина in vitro показало, что фибриллы почти в два раза снижают активность АТФазы актомио-зина (табл. 1), что указывает на возможность их прямого негативного влияния на сократительную функцию мышц. Важно отметить, что разрушение амилоидных фибрилл антибиотиком и его противодействие образованию новых амилоидов сопровождалось восстановлением АТФазы актомиози-на почти до исходного уровня.
В связи с тем, что амилоидные отложения были найдены в сердце и кровеносных сосудах, клеточная токсичность была исследована в культуре клеток полиморфноядерных лейкоцитов (ПМЯЛ) на примере амилоидных фибрилл Х-белка. Обнаружено, что выживаемость клеток в присутствии фибрилл начинает заметно снижаться уже после 8 ч инкубации и составляет ~70 и ~40% при кон-
ОТКРЫТИЕ АМИЛОИДНЫХ САРКОМЕРНЫХ БЕЛКОВ
555
Таблица 1. Влияние белков семейства тайтина в молекулярной форме и их амилоидных фибрилл на ЛТФазную активность актомиозина in vitro
Aктивнoсть* актин-активируемой ATФaзы миозина, %
Белок в присутствии после разрушения амилоидных фибрилл белка тетрациклином
молекул белка амилоидных фибрилл белка
Тайтин n =5 12б + 4.5 84 + 4.0 107 + 3.9
X-белок n =5 85 + 3.0 49 + 2.7 82 + 2.9
C-белок n = 5 10б + 4.2 81 + 4.0 102 + 3.8
H-белок n =5 90 + 3.0 59 + 3.5 87 + 3.0
* В отсутствие белка 100%.
центрации фибрилл в инкубационной среде 0.001 и 0.1 мг/мл соответственно. Выживаемость ПМЯЛ продолжает снижаться после 16 ч и составляет ~50 и ~20% при 0.001 и 0.1 мг/мл соответственно. Таким образом, имеется концентрационная
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.