МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 4, с. 677-681
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.218
ОЦЕНКА ЧИСЛА КОПИЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ И АДИПОЦИТАХ ПАЦИЕНТОВ С МЕТАБОЛИЧЕСКИМ СИНДРОМОМ:
ПИЛОТНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
© 2014 г. О. И. Можей13, П. А. Затолокин2, М. А. Василенко3, Л. С. Литвинова3,
Е. В. Кириенкова1,3, И. О. Мазунин1,3*
1Медицинский институт, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта,
Калининград, Россия, 236016 2Отделение реконструктивной и эндоскопической хирургии, Калининградская областная больница,
Калининград, Россия, 236016 3Инновационный парк, Балтийский федеральный университет им. Иммануила Канта,
Калининград, Россия, 236016 Поступила в редакцию 25.12.2013 г. Принята к печати 23.01.2014 г.
Метаболический синдром — комплекс метаболических, гормональных и клинических нарушений. Дефекты функционирования митохондрий играют немаловажную роль в патогенезе метаболического синдрома. В ходе настоящего исследования продемонстрировано изменение количества копий митохондри-альной ДНК (мтДНК) в образцах жировой ткани разной локализации и лейкоцитах периферической крови у пациентов с метаболическим синдромом, ранжированных по индексу массы тела. Выявлена тенденция к истощению мтДНК при увеличении индекса массы тела.
Ключевые слова: метаболический синдром, индекс массы тела, истощение митохондриальных ДНК, адипоциты.
EVALUATING THE MITOCHONDRIAL DNA COPY NUMBER IN LEUKOCYTES AND ADIPOCYTES FROM METABOLIC SYNDROME PATIENTS: PILOT STUDY, by O. I. Mozhey1,3, P. A. Zatolokin2, M. A. Vasilenko3, L. S. Litvinova3, E. V. Kirienkova1,3, I. O. Mazunin1,3* (1Medical Institute, Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, 236016 Russia; 2Department of Reconstructive and Endoscopic Surgery, Kaliningrad Regional Hospital, Kaliningrad, 236016 Russia; 3Innovation Park, Immanuel Kant Baltic Federal University, Kaliningrad, 236016 Russia; *e-mail: IMazunin@kantiana.ru). The metabolic syndrome is a complex of metabolic, hormonal and clinical disorders. Defects in mitochondrial functions play an important role in the metabolic syndrome pathogenesis. Here, mitochondrial DNA (mtDNA) copy number variations were evaluated different fat tissue and peripheral blood leukocyte samples from metabolic syndrome patients ranked by body mass indexes. It was elucidated a tendency in decreasing the mtDNA copy number with increasing a body mass index.
Keywords: Metabolic syndrome, body mass index, mitochondrial DNA copy number, adipocytes.
10.7868^0026898414040077
В современной медицине метаболический синдром (МС) рассматривается как одна из важных социально значимых проблем. Основными симптомами МС считаются абдоминальное ожирение, инсулинорезистентность, гипергликемия, дисли-пидемия, артериальная гипертония, нарушения в системе гемостаза, хроническое субклиническое воспаление. Согласно современным представлениям, для всех проявлений МС характерна инсу-
* Эл. почта: IMazunin@kantiana.ru
линорезистентность и сопутствующая ей системная гиперинсулинемия. С одной стороны, гипе-ринсулинемия — это компенсаторный механизм, необходимый для преодоления инсулинорези-стентности и поддержания нормального транспорта глюкозы в клетки; с другой — патологический фактор, способствующий возникновению и развитию метаболических, гемодинамических и органных нарушений, приводящих в конечном
итоге к развитию сахарного диабета типа 2, ише-мической болезни сердца и других проявлений диабетической ангиопатии [1].
Митохондриальная дисфункция сопровождается широким спектром клинической симптоматики [2, 3]. В последнее время появляется все больше данных о роли митохондрий в патогенезе МС [4]. В частности показано, что дисфункция митохондрий приводит к окислительному стрессу, который инициирует развитие атеросклероза, сердечно-сосудистых заболеваний, а также инсу-линорезистентности [5]. Установлено, что изменения уровня митохондриальной ДНК (мтДНК) в лейкоцитах периферической крови так же могут приводить к окислительному стрессу и коррелируют с развитием МС [6, 7].
В данной работе проведена оценка относительного количества копий мтДНК в лейкоцитах периферической крови и образцах жировой ткани разной локализации: брыжейка тонкой кишки, большой сальник и подкожная жировая клетчатка — у пациентов с МС в зависимости от степени ожирения.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Обследовано 50 пациентов (25 мужчин и 25 женщин в возрасте от 24 до 67 лет), поступивших на плановое лечение в Областную клиническую больницу города Калининграда. Материалом для исследования служила венозная кровь и образцы белой жировой ткани различной локализации: большой сальник, брыжейка тонкой кишки, подкожная жировая клетчатка. Все обследованные пациенты были разделены на подгруппы, в зависимости от индекса массы тела (ИМТ): стадия предожирения (26—30 кг/м2); ожирение I степени (31—35 кг/м2); ожирение II степени (36—40 кг/м2); ожирение III степени (>40 кг/м2). Диагноз МС устанавливался согласно национальным рекомендациям по диагностике и лечению метаболического синдрома [8]. В каждую подгруппу входило 5 мужчин и 5 женщин. Контрольная группа состояла из 10 лиц со значениями ИМТ в пределах нормы (<24.9 кг/м2) и с возрастными и тендерными показателями, сопоставимыми с испытуемыми пациентами.
Образцы венозной крови получали при пункции локтевой вены с использованием вакуумной системы забора крови Vacutest с антикоагулянтом (КЗ-ЭДТА). В течение 2—3 суток кровь пассивно фракционировали при +4°С, после чего отбирали лейкоцитарно-тромбоцитарный слой для выделения ДНК. ДНК выделяли, используя DNeasy Blood & Tissue Kit ("QIAGEN", Германия), согласно протоколу производителя. До проведения эксперимента тотальную ДНК хранили при температуре —80°С.
Образцы жировой ткани получали от больных МС и от пациентов группы контроля в ходе выполнения плановых хирургических операций (желчнокаменная болезнь, хронический холецистит или паховая грыжа) с обязательным подписанием информированного согласия на использование биологического материала в эксперименте. До проведения эксперимента жировую ткань хранили при температуре —80° С. Жировую ткань гомогенизировали и выделяли ДНК, используя DNeasy Blood & Tissue Kit. Концентрацию ДНК измеряли спек-трофотометрически на приборе NanoVue Plus ("GE Healthcare", США).
Относительное количество мтДНК измеряли с помощью ПЦР в реальном времени, используя реагент LightCycler® 480 DNA SYBR Green I Master ("Roche", Швейцария), согласно протоколу производителя. В каждую реакционную смесь входило 3 нг ДНК, концентрация олиго-нуклеотидных праймеров составляла 10 пМ. Ам-плифицировали фрагмент гена тРНК лейцина. В качестве нормировочного гена использовали фрагмент ДНК гена ß-2-микроглобулина. Последовательности праймеров для мтДНК: (прямой) 5'-CACCCAAGAACAGGGTTTGT-3' и (обратный) 5'- TGGCCATGGGTATGTTGTTA-3' - и для нормировочного гена ß-2-микроглобулина: (прямой) 5'- TGCTGTCTCCATGTTTGATG-TATCT-3' и (обратный) 5'- TCTCTGCTCCCCAC-CTCTAAGT-3' [9].
Олигонуклеотидные праймеры синтезировали с помощью фосфорамидитного метода на AMS-2000 ("Биоссет", Россия) и очищали методом обращено-фазовой хроматографии на OPS-1000 ("Биоссет"), используя реагенты компании "Glen Research" (США).
ПЦР проводили в трех повторах на амплифи-каторе LightCycler® 480 System ("Roche", Швейцария), в режиме: 95°С 5 мин; 95°С 30 с, 58°С 45 с, 72°С 60 c, 45 циклов; 72°С 10 мин. Специфичность реакции оценивали по температуре плавления полученных ампликонов. Число копий мтДНК оценивали по значениям величины порогового цикла Ct (treshold cycle, точка пересечения графика накопления ДНК и пороговой линии), позволяющей судить об исходном количестве копий ДНК и сравнивать образцы между собой [9]. Анализ данных осуществляли с помощью программы STATISTICA 10. Для каждого анализируемого показателя вычисляли среднее значение (M) и стандартное отклонение (а). Для оценки достоверности различий между независимыми выборками применяли непараметрический критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при уровне значимостир < 0.01.
ОЦЕНКА ЧИСЛА КОПИЙ МИТОХОНДРИАЛЬНЫХ ДНК В ЛЕЙКОЦИТАХ
679
Уровень мтДНК в образцах периферической крови (а) и тканей: подкожной жировой клетчатки (б), брыжейки тонкой кишки (в) и большого сальника (г) — у пациентов с различным значением ИМТ. (*) — р < 0.01 и (**) — р > 0.05 при сравнении данной группы с контрольной. АО — разница между пороговыми циклами таргентного и нормировочного генов. Ползунками указано стандартное отклонение.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На рисунке (график а) представлены результаты количественного анализа числа копий мтДНК в лейкоцитах периферической крови пациентов с МС, ранжированных по ИМТ, в сравнении с аналогичными значениями у лиц с ИМТ в норме. В целом, выявлена тенденция к снижению количества копий мтДНК в лейкоцитах крови при увеличении ИМТ. Наиболее выраженные изменения регистрировали у пациентов со степенью ожирения III (р < 0.01).
Как видно по данным, представленным на графике б рисунка, корреляции между уровнями мтДНК в этих образцах и значениями ИМТ пациентов не выявлено.
На графике в представлены результаты по числу копий мтДНК в образцах брыжейки тонкой кишки пациентов с различными стадиями МС. У лиц с предожирением и степенью ожирения II зафиксировано достоверное уменьшение числа копий мтДНК относительно группы сравнения (р < 0.01). Количественные уровни мтДНК в образцах бры-
жейки тонкой кишки у пациентов с ожирением I и III степени не отличались от контрольных значений.
Достоверное снижение уровня мтДНК в ткани большого сальника наблюдалось лишь у пациентов с МС, имеющих III степень ожирения (по сравнению с контрольной группой, p < 0.01) (график г).
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Митохондрии выполняют в клетке множество функций, наиболее важная из которых — выработка энергии путем окислительного фосфорилирова-ния. В отличие от других органелл, митохондрии имеют собственную ДНК, которая кодирует некоторые субъединицы комплексов окислительного фосфорилирования [3]. В метаболизме мтДНК участвуют определенные ядерные гены, координирующие к
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.