БИОФИЗИКА, 2015, том 60, вып. 5, с. 922-930
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ1
УДК 577.357.464.23
ОЦЕНКА ФОТО- И ЦИТОТОКСИЧНОСТИ ЭТЕРИФИЦИРОВАННЫХ ПPОИЗВОДНЫХ ХЛОРИНА е6 И ИX ЛИПОСОМАЛЬНЫХ ФОРМ
© 2015 г. Т.Е. Зорина, И.В. Янковский, И.Е. Кравченко, Т.В. Шман*,
М.В. Белевцев*, В.П. Зорин
Белорусский государственный университет, 220030 Минск, просп. Независимости, 4, Республика Беларусь
E-mail: zorinate@mail.ru *Республиканский научно-практический центр детской онкологии, гематологии и иммунологии, 223053, д. БоровляныМинской области, ул. Фрунзенская, 43, Республика Беларусь Поступила в p едакцию 20.05.15 г.
П роведено исследование фотофизических свойств и фотосенсибилизирующей активности эте-рифицированных производных хлорина еб - диметилового и триметилового эфиров - в различных растворах и в составе липосомальных форм. Включение в липосомальную форму производных хлорина еб обеспечивает их мономерность в водных растворах, позволяет полностью сохранять оптимальные фото физические свойства и фотохимическую активность. Установлено, что скорость перераспределения диметилового эфира хлорина еб из липидных везикул на клетки значительно выше в ср авнении с триметиловым эфиром хлорина еб, белки сыворотки крови оказывают разнонаправленное влияние на данный процесс. На клеточных культурах показано, что применение липосомальных форм производных хлорина еб значительно снижает их цитотоксичность; при этом сохраняется высокий цитотоксический эффект фотодинамического воздействия этерифицированных производных хлорина еб.
Ключевые слова: фотосенсибилизаторы, липосомальные формы, производные хлорина е$, фотофизические характеристики, цитотоксичность.
Одним из ограничений в использовании многих фотосенсибилизаторов в методе фотодинамической терапии является необходимость создания лекарственных форм, обеспечивающих возможность их введения в ор ганизм. Активные субстанции наиболее эффективных фотосенсибилизаторов второго поколения (У18иёше, Бо8-сап, Тоокаё, Фотолон и др.) нерастворимы в водной среде, применение их в клинике сопряжено с использованием специальных фармакологических форм [1,2]. Наноразмерные липид-ные везикулы являются наиболее популярной формой для введения неполярных лекарственных соединений. Включение в липидные везикулы обеспечивает мономерное состояние и высокую фотосенсибилизирующую активность в водных раствор ах большинства гидрофобных тетрапиррольных фотосенсибилизаторов [3,4]. Вместе с тем использование липосомальных форм для введения фотосенсибилизаторов требует проведения дополнительных исследований,
Сокращения: Хл е6 - хлорин е6, ДМЭ - диметиловый эфир хлорина е6, ТМЭ - триметиловый эфир хлорина е6, ДМФХ - димеристоилфосфатидилхолин.
так как фотофизические и фармакокинетиче-ские характеристики препарата в этом случае зависят не только от свойств самого фотосенсибилизатор а, но и от стр уктурных характеристик нанор азмерных липидных везикул.
Ранее было показано, что химическая модификация хлор ина е6 (Хл е6), связанная с эте-рификацией боковых карбоксильных групп, позволяет получить более эффективные для целей фотодинамической терапии сенсибилизирующие соединения - производные Хл еб. Высокая фотодинамическая активность производных Хл еб была показана in vivo на животных-опухо-леносителях с перевитой саркомой [5]; установлена высокая избирательность действия производных Хл еб в отношении лейкозных клеток при различных гематологических патологиях [б]. На моделях ex vivo получены данные, позволяющие полагать, что диметиловый эфир Хл еб (ДМЭ) может быть с успехом использован для р азвития новых технологий лечения заболеваний, основанных на контролируемом фо-тосенсибилизированном повреждении новообразованных сосудов глазного дна [7,8].
Длина волны, нм
Рис. 1. Cтpуктуpные фоpмулы xлоpина е6, его пpоизводных и ноpмиpованные cпектpы поглощения ДМЭ в ацетоне и в экстр узионных липосомах из ДМФХ. Стр уктур ные фор мулы - X л еб: К^К^К^Н; ДМЭ: Н, ^2=^3=СНз; ТМЭ: К1=К2=Кз=СНз. Спектр ы поглощения - ДМЭ в ацетоне (7); ДМЭ в экстр узионных липосомах из ДМФХ (2). Соотношение ДМЭ:ДМФХ = 1:40.
Этер ифицир ованные пр оизводные Хл е6 являются неполярными соединениями и практически нер аствор имы в воде. Это обуславливает необходимость пр именения для их введения ли-посомальных форм.
В данной работе проведено исследование спектр альных и фото сен сибилизир ующи х свойств производных Хл е6 и их комплексов с униламелляр ными липидными везикулами, пр о -анализированы особенности процессов накопления и пр оведена оценка цито- и фототоксичности пр оизводных Хл е6 в клетках пр и их введении в раствор ах и в со ставе липосомаль-ных форм.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Фотосенсибилизаторы и их липосомальные
формы. С интез хлор инов пр оводили по моди-фицир ованной методике Фишер а и Орта [9]. П р и синтезе неполяр ных хлор инов, диметило -вого эфир а Хл е6 и триметилового эфир а Хл е6 (ТМЭ), в качестве и сходных суб станций и с-пользовали феофитин или Хл е6. Чистоту Хл е6 и его пр оизводных контр олир овали хр ома-тогр афически. Содер жание о сновного вещества в пр епар атах со ставляло более 95%. Структурные фо р мулы исследуемых хлор инов пр едстав-лены на р и с. 1.
Липосомы, нагруженные хлоринами в оп-р еделенном соотношении липид:пигмент, готовили из синтетического димеристоилфосфати-дилхолина (ДМФХ), пр оизводства Sigma (C ША), на ручном эк ст р уд ер е Avanti Mini-Extruder (метод Бенгема), используя поликарбонатные мембр анные фильтр ы «Кис1ероге@» (Whatman, Великобритания) с порами 100 нм. Фотосен сибилизатор ы вводили в липидные везикулы на стадии получения липидной пленки. P азмер везикул опр еделяли методом динамического светор ассеяния, диаметр липосом, нагруженных производными Xл е6, составлял 110 ± 2 нм. C тепень включения хлор инов в липидные везикулы составляет более 90% для ДМЭ и более 85% для ТМЭ.
Фотофизические характеристики хлорина е6 и его производных. И сследования спектр ов элек -тр онного поглощения пр оводили с помощью спектр офотометр а Solar PV 1251с (C ОЛАР, Беларусь ). C пектр ально-флуо р есцентные хар актер истики пигментов исследовали на спектр о -флуориметре Solar SEL-m^ (CОЛАР, Бела-р усь). Квантовые выходы флуо р есценции ф исследуемых соединений определяли по стандартной методике, в качестве эталона использовали раствор тетрафенилпорфина в толуоле (ф = 0,09).
Время жизни флуоресценции пигментов из-мер яли на импульсном флуорометр е PRA-3000 (Канада), работающем в режиме счета фотонов. Квантовый выход генерации синглетного кислорода определяли на лазерном флуорометре в Институте физики им. Б .И. Степанова НАН Белар уси по методу, описанному в работе [10].
Клеточные культуры. В работе были использованы клетки лейкемической линии лим-фоидного происхождения Raji (коллекция клеточных культур РНПЦ детской онкологии, гематологии и иммунологии). Суспензии клеток культивировали в ср еде RPMI-1640 (Sigma, США), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Sigma, США). П р и исследовании клетки отмывали и переводили в среду с различным содер жанием эмбриональной телячьей сыворотки.
Исследование параметров накопления фотосенсибилизаторов клетками. И сследование про -цессов накопления пигментов в клетках проводили на проточном цитофлуориметре FC 500 (Весктап Coulter, США) согласно стандартной методике [11]. В качестве источника возбуждения использовали аргоновый лазер с длиной волны 488 нм (W = 20 мВт). Характеристики процессов накопления фотосенсибилизаторов клетками определяли на основании измерений интенсивности флуоресценции в полосе испускания хлоринов. Средние значения интенсивности флуоресценции клеточных популяций в каждом временном интервале рассчитывали с помощью статистического пакета программ СХР (Весктап Соикег, США).
Определение цитотоксичности хлоринов. Определение темновой цитотоксичности фотосенсибилизатор ов пр оводили с помощью МТТ-тес-та по модифицированной методике, описанной в работе [12]. В пр обы, содержащие ср еду RPMI-1640 с 5% эмбриональной телячьей сыворотки, добавляли Хл е6 или его производные в р азных концентрациях от 2-10-6 до 2-10-4 М и выдерживали в термостате (37°С) в течение 1 ч для мономеризации пигментов. Клетки Raji в концентрации 1-106 клеток/мл помещали в подготовленные пробы и инкубировали при 37°С в течение 4 ч. По окончании инкубации клетки отмывали, ресуспендировали, в каждую пробу добавляли 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиум бромид (5 мкг/мл) и продолжали инкубировать в течение 5 ч. Затем для растворения образовавшихся гранул фор-мазана в пробы добавляли кислый изопропанол (конечная концентрация Н С1 0,04 Н), тщательно ресуспендировали и инкубировали в темноте при комнатной температуре до растворения гранул. Оптическую плотность определяли при
длине волны 540 нм на многофункциональном микропланшетном детекторе 7епуШ (ЛпШо8, Австрия).
Сравнение фотозависимой цитотоксичности производных Хл е6 Для проведения фотосен-сибилизир ованного воздействия клетки Иа^ инкубировали в средах с различным содержанием производных Хл еб или их липосомальных форм в течение 1 ч (для ТМЭ - 4 ч) при температуре 37°С, дважды отмывали от несвязавшегося фотосенсибилизатора и облучали диодным лазером (X = бб0 нм) с регулируемой мощностью облучения (ИЛМ-бб0-0,5; «ЛЭМТ», Беларусь). Фотооблучение проводили при комнатной температуре. Аликвоты суспензии клеток отбирали через определенные промежутки времени для определения числа поврежденных клеток в тесте с пропидиумом иодидом, как описано в работе [13]. Образцы анализировали на проточном ци-тофлуориметре РС 500.
Данные исследования темновой и фотозависимой цитотоксичности пр едставляли как средние значения ± стандартная ошибка (М ± т). Все представленные данные являются результатом не менее трех повторных экспериментов.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Фотофизические характеристики производных Хл еб в растворах и в липидных везикулах.
П роизводных X л еб в мономер ной форме имеют близкие спектральные и фотофизические характеристики. Отличия в положении основных полос в спектр ах поглощения для их растворов в органических растворителях не превыша
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.