КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ
УДК 575.174.015.3:599.735.5
ОЦЕНКА ГЕНЕТИЧЕСКОГО РАЗНООБРАЗИЯ РОМАНОВСКОЙ ПОРОДЫ
ОВЕЦ С ПОМОЩЬЮ КОЭФФИЦИЕНТА ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ОРИГИНАЛЬНОСТИ НА ОСНОВЕ ДАННЫХ ISSR-ФИНГЕРПРИНТИНГА
© 2015 г. Л. В. Нестерук1, Н. Н. Макарова2, Г. Р. Свищева1 3, Ю. А. Столповский1
Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: lyubov-kas@mail.ru, stolpovsky@mail.ru 2ООО "АгриВолга", Углич 152615 3Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирск 630090
Поступила в редакцию 19.09.2014 г.
Для сохранения и управления отечественными породами сельскохозяйственных животных требуется оценка состояния их генетического разнообразия, оригинальности породной структуры. Объектом нашего исследования является романовская порода овец ведущих племенных и генофондных хозяйств Ярославской области России. В качестве молекулярного метода изучения генофондов овец был использован ISSR-фингерпринтинг. С помощью двух праймеров ((AG^C и (GA^C) было обнаружено 43 фрагмента ДНК, 25 и 18 соответственно. Из всех обнаруженных ISSR-маркеров 81% оказались полиморфными. Для изучения специфичности и оригинальности генофонда романовской породы впервые использован коэффициент генетической оригинальности. На основании его значений исследуемые особи были разделены на пять классов в зависимости от частоты встречаемости ISSR-фрагмента. В генофонде романовских овец были выделены наиболее оригинальные или редкие, а также типичные генотипы. Полученные данные по генетической оригинальности предложено использовать для повышения эффективности селекционно-племенной работы при разведении автохтонных пород доместицированных видов животных.
DOI: 10.7868/S0016675815070097
Романовская порода овец — это уникальная отечественная порода короткотощехвостых овец, которая относится к грубошерстным породам мясо-шубного направления продуктивности. Она была выведена в Романово-Борисоглебском уезде Ярославской губернии в конце XVIII в. Романовская порода считалась и считается гордостью российского животноводства. Романовские овцы являются примером сочетания ряда ценных признаков: высокая плодовитость, великолепное качество овчины, хорошие мясные качества и скороспелость. Это одна из немногих пород российского происхождения, которая имеет трансграничный статус, т.е. разводится во многих странах мира, где благодаря своей универсальной продуктивности сохраняется в чистоте и активно используется для улучшения местных пород овец. К сожалению, к концу ХХ в. в России численность породы упала до критических размеров. В 1990 г. романовских овец насчитывалось 317174 головы, а на начало 2013 г., по данным ВНИИплем, численность составила 16400 голов во всех категориях хозяйств [1, 2]. Основное сокращение численности произошло в период экономических преобразований (90-е годы ХХ в.): к 1999 г. романовских овец насчитывалось уже меньше 23 тысяч голов, из них овцематок и ярок старше одного
года менее половины [3]. Попытки "улучшения породы" и резкое сокращение численности поставили породу на грань исчезновения. Усилия селекционеров с участием государственной и частной поддержки позволили породе сохраниться. Однако резкое сокращение поголовья негативно сказалось на жизнеспособности и продуктивности романовских овец. Сегодня при их разведении возникают вопросы, связанные с инбридингом, чистотой породы (чистопородностью), сохранением лучших хозяйственно полезных качеств. В связи с этим задача по изучению внутрипородного разнообразия, сохранению оригинальной породной генетической структуры становится актуальной как для настоящей, так и будущей селекции. В нашей работе для изучения генофонда романовских овец мы использовали метод классификации внутри-породного разнообразия по результатам молекулярного маркирования, представленный ранее Е.К. Потокиной и Т.Г. Александровой для бобовых растений [4, 5]. Этот метод также был успешно использован для оценки состояния генофондов растений при анализе спектров фрагментов ДНК, полученных методами ISSR (Inter-Simple Sequence Repeats) и IRAP (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism) [6]. Мы применили этот
847
8*
метод для изучения генетического разнообразия генофонда романовских овец.
Исходным материалом для исследования послужили образцы крови от 300 овец романовской породы из пяти хозяйств Ярославской области: ООО "Агрофирма Авангард" (N = 80), ООО "Агрофирма Земледелец" (40), ООО "Дружба" (40), ООО "Заречье" (100), ООО "Красный Перекоп" (40).
Исследование полиморфизма фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитных локусов, выполняли стандартным методом, разработанным в работе [7]. Для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР, PCR) из образцов крови овец выделяли геномную ДНК, в качестве праймеров в реакционную смесь добавляли олигонуклеотиды (AG)9C и (GA)9C. ПЦР проводили на термоцик-лере DNA Engine Dyed (BioRad) с применением набора сухих реагентов для ПЦР амплификации ДНК GenePak™ PCR Core (Изоген, Москва).
Обработку данных осуществляли с помощью программ Microsoft Excel и среды R. Для каждого полиморфного ISSR-фрагмента был рассчитан "вес" его присутствия (1) и отсутствия (0) у каждого образца на основании частот встречаемости фрагмента в изучаемой выборке (табл. 1). Затем исходная матрица присутствия—отсутствия фрагментов замещалась матрицей соответствующих "взвешенных" значений. Далее "веса" всех ISSR-фрагментов суммировались для каждой особи, и сумма делилась на число проанализированных полиморфных ISSR-фрагментов. Данный метод основан на принципе Смирнова по "взвешиванию" признаков в зависимости от частоты их встречаемости. Индекс, который получен в результате усреднения "весов" всех полиморфных в данной выборке фрагментов, был назван Е.К. Потоки-ной и Т. Г. Александровой коэффициентом генетической оригинальности (КГО) [4, 8, 9].
В данной работе проанализировано 300 овец романовской породы из пяти ведущих генофонд-ных и племенных хозяйств Ярославской области. Для каждой популяции с помощью праймеров определены специфические спектры фрагментов ДНК в диапазоне от 2500 до 160 пн. Всего по двум праймерам было выявлено 43 фрагмента ДНК (25 фрагментов по (AG)9C и 18 — по (GA)9C), 35 из которых были полиморфными (20 фрагментов по (AG)9C и 15 — по (GA)9C). Изученные группы животных романовской овцы имели отличия как по наличию/отсутствию, так и по частоте встречаемости определенных фрагментов в спектрах амплификации. Например, только в популяции из "Заречья" встречается фрагмент А23 размером 530—550 пн (частота встречаемости — 0.130), в других исследованных группах данного фрагмента нет. Фрагмент А9 (1290—1240 пн) обнаружен с
высокой частотой (0.563—0.650) в отарах из "Агрофирмы Авангард" и "Агрофирмы Земледелец" и с незначительной частотой (0.125) в хозяйстве "Дружба", а в хозяйствах "Заречье" и "Красный Перекоп" вышеуказанный фрагмент ДНК отсутствует. Фрагмент А14 (940—990 пн) не встречается в популяции "Красного Перекопа", но почти со стопроцентной частотой обнаружен в спектрах амплификации овец "Агрофирмы Земледелец" [10].
Стандартные оценки генетического разнообразия у исследованных популяций романовской породы овец представлены в табл. 2. Анализируя полученные данные, видно, что наибольшее генетическое разнообразие по праймеру (АО)9С выявлено у овец из "Агрофирмы Авангард". Аналогичные результаты получены по праймеру (ОА)9С. Наименьшие значения всех параметров генетического разнообразия по обоим праймерам зафиксированы у овец из "Красного Перекопа".
Полученные данные по 188Я-полиморфизму стали основой для решения задачи по определению наиболее типичных и оригинальных особей и популяций (отар) с точки зрения разнообразия и их соответствия породе. В дальнейшем предстояло структурировать полученные данные и провести оценку современного состояния генофонда романовской породы.
На основании данных по частотам 188Я-мар-керов, полученных с использованием обоих праймеров, были вычислены значения коэффициента генетической оригинальности (табл. 1). Полученная выборка значений КГО имеет смешанный тип, поскольку включает в себя значения КГО животных из разных хозяйств. Для того чтобы распределение выборки можно было аппроксимировать смесью нормальных распределений, значения КГО были логарифмированы по основанию 2 и обозначены далее как х. Анализ распределения выборки при использовании двустороннего критерия Колмогорова—Смирнова показал, что выборка х может быть описана смесью двух нормальных распределений (Р-уа1иг = 0.9):
/х) = 0.63/1(х) + 0.37/2(х),
где /1(х) и /2(х) — функции нормального распределения с параметрами распределения (ц1 = —0.92, ст1 = 0.64) и (ц2 = 0.36, ст2 = 1.06) соответственно. На рис. 1 (а, б и г) представлены: гистограмма, функция плотности распределения /(х) с компонентами /1(х) и/2(х), а также диаграмма "Ъохр1о1", показывающая медиану, 25%-ный и 75%-ный квантили, минимальное и максимальное значения выборки и выбросы.
Разделение особей на группы в соответствии с их КГО проходило с использованием пятибалльной шкалы классификации, которая соответствует интервалам между минимальным, максимальным значениями выборки х и 5%-ным, 25%-ным,
и М и н к
Таблица 1. Схема расчета коэффициента генетической оригинальности (КГО) генофонда романовской породы овец на основании полиморфизма АО- и ОА-КБК-РСЫ-маркеров
Исходная матрица присутствия/отсутствия КЗК-фрагментов у особей
Номер в популяции
А6
А9
А12
А14
А16
'Взвешенные" на основе частоты встречаемости в выборке значения присутствия/отсутствия 188К-фрагментов
Номер в популяции
А6
А9
А12
А14
А16
КГО = Е/и
1.оц2КГО
КГО
по шкале
О К и я
м
И Я
И
н
Л
и
о §
"Ч
о £
и! Я О
о £
и!
О
я о
И
о *
о я=
я
о §
Е
о а и к
00 чо
РОА26
РОА26
0.05
2.95
0.23
0.62
0.45
22.99
0.66
-0.61
£
РОА27
РОА27
0.05
2.95
0.23
0.62
0.45
21.29
0.61
-0.72
РОА28
РОА28
0.05
2.95
4.36
1.61
0.45
42.54
1.22
0.28
РОА29
РОА29
0.05
2.95
0.23
1.61
0.45
67.73
1.94
0.95
РОАЗО
РОАЗО
0.05
2.95
0.23
0.62
0.45
15.32
0.44
-1.19
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.