ЖУРНАЛ АНАЛИТИЧЕСКОЙ ХИМИИ, 2007, том 62, № 2, с. 198-203
^=ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 543.544
ОЦЕНКА КОНСТАНТ УСТОЙЧИВОСТИ ОРГАНИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ КИСЛОТНОГО И ОСНОВНОГО ХАРАКТЕРА С 18-КРАУН-6 И Р-ЦИКЛОДЕКСТРИНОМ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОГО ЗОННОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
© 2007 г. Л. А. Карцова*, А. М. Попова*, А. А. Сидорова**, О. И. Маркова**
*Санкт-Петербургский государственный университет 198504 Санкт-Петербург, Петродворец, Университетский просп., 2 **000 ЦКП "Аналитическая спектрометрия" 195220 Санкт-Петербург, ул. Гжатская, 27, лит. А Поступила в редакцию 06.08.2005 г., после доработки 17.02.2006 г.
На примере разделения смеси кислот (гомованилиновой, ванилилминдальной, 5-гидроксииндол-3-уксусной, 3,4-дигидроксифенилаланина) и оснований (адреналина, норадреналина, дофамина, серо-тонина, метанефрина) при введении в буферный электролит Р-циклодекстрина и 18-краун-6, соответственно, показана возможность оценки констант устойчивости в системе "аналит-макроцикл" методом капиллярного зонного электрофореза. Обсуждается информативность полученных констант при разделении смесей биологически важных объектов для нахождения оптимальной концентрации комплексообразователя в рабочем электролите.
Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) -широко используемый метод анализа ионоген-ных органических соединений, который обладает высокой эффективностью, но недостаточной селективностью по сравнению с ВЭЖХ, что связано с наличием лишь одной фазы.
Одним из способов увеличения селективности разделения сложных смесей органических соединений является введение макроциклической добавки -краун-эфиров и циклодекстринов - в состав элек-трофоретических систем. Первые используют при анализе щелочных и щелочноземельных металлов, органических соединений, содержащих аминогруппы (аминокислот, биогенных аминов, ней-ропептидов), вторые - особенно широко при разделении фармацевтических препаратов, в том числе и оптических изомеров.
Селективность разделения обусловлена как образованием комплексов включения аналитов в полость макроцикла, так и различными специфическими и неспецифическими взаимодействиями в системе "макроцикл - аналит". Оценка констант устойчивости облегчает интерпретацию экспериментальных данных и позволяет прогнозировать возможный порядок элюирования аналитов. Последнее является важным этапом оптимизации условий разделения сложных смесей.
Известно, что циклодекстрины способны образовывать комплексы типа "гость - хозяин" с органическими веществами, за счет включения гидрофобных фрагментов аналита в полость макроцикла и взаимодействия функциональных групп с
внешними гидроксильными группами циклодекс-трина. Наиболее коммерчески доступным является ß-циклодекстрин (ß-ЦД).
Образование комплексов включения катион-ных и нейтральных субстратов с 18-краун-6 обусловливается водородными связями, диполь-ди-польными и ион-дипольными взаимодействиями, а также соответствием размеров субстрата и полости макроцикла.
В данной работе разделяли смеси кислот: гомованилиновой (HVA), ванилилминдальной (VMA), 5-гидроксииндол-3-уксусной (HIA), 3,4-дигидрок-сифенилаланина (DOPA), а также смеси биогенных аминов: адреналина (A), норадреналина (NA), дофамина (DA), серотонина (Ser), метанефрина (MN) (рис. 1) методом КЗЭ при введении в буферный электролит ß-ЦД и 18-К-6, соответственно. Определение этих соединений является важной задачей для клинической медицины при диагностике сердечно-сосудистых и нервных заболеваний, а также при развитии опухолевых процессов (фео-хромоцитома, нейробластома, ганглиома и др.).
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Реактивы и материалы. Подкисленные водные растворы стандартов кислот содержали: го-мованилиновую, ванилилминдальную, 5-гидрок-сииндол-3-уксусную кислоты ("Sigma"); (DL)3,4-дигидроксифенилаланин ("MP Biomedical") и бен-зиловый спирт (маркер электроосмотического потока (ЭОП)) по 5 мг/л каждого. Подкисленные
Гомованилиновая кислота (HVA) Ванилилминдальная кислота (VMA)
pKa(COOH) 4.35
OCH3
COOH pKa(COOH) 3.43
3,4-Дигидроксифенилаланин (DOPA) 5-Гидроксииндол-3-уксусная кислота (HIA)
HO
HO^^2
COOH
HO
COOH
pKa(COOH) = 2.32 pKa(NH2) 8.7
•N H
pKa(COOH) 4.7
Дофамин (DA)
HO
NH2
OH
pKa(NH2) 10.6
Норадреналин (NA) OH
,NH2
HO
OH pKa(NH) 8.64
Серотонин (Ser)
HO
pKa(NH2) 9.8
NH2
Метанефрин (MN) OH
NH \
HO
OCH3 pKa(NH) 8.70
Адреналин (A) OH
HO
NH
OH
pKa(NH) 8.66
Рис. 1. Структурные формулы ароматических кислот и биогенных аминов.
водные растворы стандартов биогенных аминов содержали: (-)норадреналин, (-)адреналин, (^)мета-нефрина гидрохлорид, дофамина гидрохлорид, серотонина гидрохлорид ("Sigma") и бензимида-зол ("Fluka") (внутренний стандарт) по 10 мг/л каждого.
Для приготовления буферных растворов использовали Na2B4O7 ■ 10 H2O (х.ч.), HCl ("Экрос", х.ч.), ацетонитрил ("Вектон", ос.ч.), диметилсуль-фоксид ("Реахим", х.ч.), в-циклодекстрин гидрат ("Sigma"); лед. CH3COOH ("Вектон", х.ч.), триэта-ноламин (х.ч.), 18-краун-6 ("Sigma").
Аппаратура. Кислоты анализировали на системе КЭ "Капель 103 РЕ" (Люмекс, СПб) с фотометрическим детектированием в потоке (к 254 нм). Ввод пробы гидродинамический - 30 мбар 20 с,
рабочее напряжение - 20 кВ. Использовали немо-дифицированный кварцевый капилляр (общая длина - 57 см, эффективная длина - 29 см, внутренний диаметр - 75 мкм, внешний диаметр - 365 мкм). Значение сигнала детектора выводили на экран монитора и обрабатывали с помощью ПО "Муль-тихром".
Анализ биогенных аминов проводили на системе КЭ "Agilent 1100 CE" (Hewlett Packard, USA) с УФ-ВО детектором на диодной линейке (к 190600 нм). Детектирование осуществляли в потоке (к 220 нм). Ввод пробы гидродинамический -50 мбар 20 с, рабочее напряжение - 30 кВ. Использовали немодифицированный кварцевый капилляр (общая длина - 60 см, эффективная длина -50 см, внутренний диаметр - 50 мкм). Сигнал де-
|Meff, cm2/kv s 0.165 0.160 0.155 0.150 0.145 0.140 0.135 0.130 0.125 0.120
генных формах (свободной и связанной) можно записать:
■ DOPA о VMA a HVA ▼ HIA
-0.002 0.002 0.006
0.010 0.014 [CD], M
Meff :
M - а -
'a a
+ M -а - - для слабой кислоты,
CA CA " '
Meff - MHB+aHB+
+ MCHH+ acHB+ - для слабого основания,
где ai, - молярная доля i-ой формы аналита; -электрофоретическая подвижность i-ого аналита.
Эффективные электрофоретические подвижности аналитов (|eff) рассчитывали по формуле:
Meff
= ( 1 _ 1.) L
t tj U>
(1)
Рис. 2. Зависимости электрофоретических подвиж-ностей аналитов от концентрации ß-ЦД в боратном буфере.
тектора обрабатывали с использованием программного обеспечения ("ChemStation"), поставляемого фирмой производителем прибора.
При анализе кислот использовали следующие буферы: боратный pH - 8.14, 28.6 мМ (по буре); боратный буфер + 15% диметилсульфоксида по объему, 24.3 мМ (по буре); боратный буфер + + 30% ДМСО по объему, 20.0 мМ (по буре); боратный буфер + 10% ацетонитрила по объему (20.0 мМ) по буре. Концентрацию ß-ЦД в буферах, содержащих органический модификатор, варьировали в пределах 0-30 мМ, в водном буфере -0-15 мМ.
При определении биогенных аминов использовали в качестве рабочих электролитов: уксусную кислоту (0.175 М) + триэтаноламин (10 мМ) pH 3.0, с содержанием 18-К-6 (0-125 мМ).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В основе рассмотренной физико-химической модели лежат следующие ограничения: стехиометрия комплексообразования 1:1; аналит существует в буферном электролите в единственной ионогенной форме; конкурирующее комплексо-образование отсутствует; концентрация макроцикла много больше концентрации аналитов; время установления системы равновесий [1] с участием макроцикла много меньше времени анализа.
Для эффективной электрофоретической подвижности аналита (|eff) в двух возможных ионо-
где t - время элюирования аналита (с); teop - время элюирования ЭОП (с); L - эффективная длина капилляра (см); l - общая длина капилляра (см); U -рабочее напряжение (кВ).
Константы устойчивости кислот/биогенных аминов с макроциклами (KCA) рассчитывали методом линейной регрессии с помощью Microsoft Excel по уравнению [2]:
-J_ =_1_J-+ 1 (2)
Meff - Ma (Mca - Ma)Kça [C] (|ça - Ma)
где MA - электрофоретическая подвижность свободной формы аналита, |CA - электрофоретическая подвижность связанной формы аналита, [с] - концентрация макроцикла в буферном электролите.
Отметим, что полного разделения кислот и биогенных аминов в отсутствие макроциклов достичь не удалось.
Определение ароматических кислот. При разделении ароматических кислот использовали щелочной буфер, поэтому кислоты с pKa(COOH) 2-4) разделяются в виде анионов. В качестве маркера электроосмотического потока (ЭОП) использовали бензиловый спирт.
Поскольку ß-ЦД лучше растворим в водно-органических растворителях, введение органического модификатора (ацетонитрила и диметил-сульфоксида) в буферный электролит позволило расширить диапазон концентраций макроцикла от 15 мМ для водного буфера до 30 мМ для водно-органического.
Для повышения растворимости ß-ЦД в рабочем электролите концентрация диметилсульфоксида (ДМСО) была увеличена до 30 об. %.
Наблюдаемые изменения эффективных электрофоретических подвижностей (|eff) от концентрации комплексообразователя (рис. 2) указывают на наличие взаимодействий в системе макро-цикл-аналит.
Уравнение (2) позволило рассчитать константы устойчивости KCA, при условии, что стехиометрия в системе аналит-макроцикл соответству-
Таблица 1. Константы устойчивости соединений ароматических кислот и биогенных аминов с макроциклами
Константа устойчивости (эксп. значение) Коэффици- Константа устойчивости
Макроцикл Аналит Условия ент детер- (литер. значение) условия,
минации метод определения
в-ЦД НУА Боратный буфер 56 ± 6 0.9990 бензоат-ион 23
НУА (28.6 мМ), рН 8.1, 25°С 27 ± 2 0.9998 салицилат-ион 65
DOPA 6 ± 1 0.9999 фосфатный буфер (2 мМ), рН 7-8, 25°С, КЗЭ, [3]
Н1А 31 ± 2 0.9998 бензоат-ион вода, 25°С потенциометрия, [4] 36
18-К-6 DA Уксусная кислота (0.175 М) + триэтаноламин 10 ± 2 0.9973 ион аммония ион н-бутиламмония 17 8.7
Ser (10 мМ), рН 3.0, 20°С 14 ± 3 0.9946 вода, 25°С потенциометрия, [5]
КА 13 ± 3 0.992
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.