РАЗВЕДЕНИЕ, СЕПЁКУИЯ, ГЕНЕТИКА
УДК 636.082.12
+ Оиенка племенных животных по попсннорфизсиу генов а ДНК
В. П. ТЕРЛЕЦКИЙ, доктор биологических наук Н. В. ДЕМЕНТЬЕВА, Е. С. УСЕНБЕКОВ, кандидаты биологических наук Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных
В последние годы изучение генетического полиморфизма стало одним из наиболее важных и плодотворных направлений как фундаментальной генетики, так и прикладных исследований. Ряд разработок в этой области успешно используют для повышения эффективности селекции сельскохозяйственных животных.
В широком смысле полиморфизм последовательностей ДНК предполагает наличие двух или нескольких экспериментально выявляемых типов организации различных нуклеотидных последовательностей в цепях ДНК. Более конкретно генетический полиморфизм можно определить как разнообразие генетических локусов, выявляемое в ходе изучения наследственного материала организма.
Локус считается полиморфным, если в популяции существуют еще два или более подобных аллеля. Однако, в случае, когда один из аллелей имеет очень высокую частоту, скажем, 99% и более, другие аллели имеют мало шансов быть выявленными. Поэтому, исходя из практической целесообразности, локус рассматривают как полиморфный только при частотах аллелей ниже 99%.
В течение ряда лет сотрудники ВНИИГРЖ проводили исследования по выяснению частот встречаемости разных аллелей генов каппа-казеина и бета-лактоглобулина (А. Ю.
Маркарян, А. С. Канапин, А. Ф. Яковлев). Исходным материалом служили образцы ДНК, выделенные, как правило, из замороженных образцов семени животных черно-пестрой и голштинской пород крупного рогатого скота племобъедине-ния «Невское» Ленинградской области. В настоящее время известны четыре аллеля каппа-казеина, обозначаемые как А, В, С, Р. Наибольшую встречаемость у большинства пород мира имеют два аллеля — А и В. В наших исследованиях было показано, что у быков черно-пестрой породы более 67% животных имели гетерозиготный генотип АВ. Доля гомозиготных особей в данной популяции оказалась небольшая и составила АА — 28% и ВВ — 5%. Выявлено ценных, с точки зрения сыроделия, носителей генотипа ВВ (выход сыра при использовании молока с этим типом каппа-казеина на 10% выше) всего 8 животных. Нужно отметить, что этот генотип не был выявлен вообще у быков голштинской породы. У животных этой породы, по сравнению с быками черно-пестрой породы, доля гетерозиготных особей была еще выше и составляла 83%. Анализ встречаемости аллелей по каппа-казеиновому локусу показал превосходство в концентрации аллеля А (0,62) над ал-лелем В (0,38).
Анализ встречаемости генетических вариантов бета-лактог-
лобулина показал, что более половины (57%) животных имеют гетерозиготный генотип АВ. Частота гомозиготных генотипов АА и ВВ была почти одинаковой — соответственно-20% и 23%. В отличие от каппа-казеинового локуса по типам гена бета-лактоглобулина обнаружено межпородное различие. Так, у быков голштинской породы частота гомозиготного варианта АА составляет 22%, а у черно-пестрой — 9%. Гетерозиготный генотип АВ наибольшую частоту имел у животных голштинской породы (74,6%). Анализ частоты аллелей гена бета-лактоглобулина показывает, что аллели данного локуса имеют почти одинаковую встречаемость (А — 0,49 и В — 0,51). Выраженного колебания частоты встречаемости аллелей гена бета-лактоглобулина в зависимости от породы не обнаружено.
Использование критерия хи-квадрат позволяет определить степень соответствия фактического распределения генотипа с его теоретическим значением. Большое несоответствие фактического распределения по всем трем генотипам каппа-казеина с теоретическим распределением установлено как для быков черно-пестрой, так и для голштинской пород. Так, отмечен недостаток гомозигот АА (44 против 60 теоретически ожидаемых) и ВВ (8 против 23). В каппа-казеиновом локу-се наблюдается значительный избыток гетерозигот АВ (104 против 73 теоретически ожидаемых) и недостаток гомозигот АА и ВВ. Критерий соответствия превышал его табличное значение почти в четыре раза (27,2). Это свидетельствует о том, что по исследуемому локусу нарушено генное равновесие. Этот эффект, видимо, можно объяснить влиянием отбора только на показатели удоя, так как среди быков-улучшателей удоя вообще не обнаружено ни одного быка-
РАЗВЕДЕНИЕ, СЕПЕКУИЯ, ГЕНЕТИКА
носителя каппа-казеина типа ВВ.
В отличие от каппа-казеинового локуса по бета-лактогло-булиновому локусу у всех животных обнаружено генное равновесие. Показатели хи-квадрат колебались от 0,53 у быков черно-пестрой породы до 6,35 у быков голштинской породы. Данный показатель в среднем по исследуемой популяции составил 2,29 и не превышал своего табличного значения при Р=0,01.
Наиболее старым методом выявления полиморфизма ДНК является использование ферментов рестрикции. Как известно, рестриктазы характеризуются способностью расщеплять двухцепочечную ДНК, узнавая строго специфическую последовательность нукпеоти-дов. Если ДНК одного из сравниваемых типов имеет точечную мутацию, либо сайт метилирования в данной последовательности, рестриктаза не сможет расщепить такой участок ДНК. Результатом будет разная картина в подвижности фрагментов ДНК (разная длина фрагментов и молекулярная масса) при анализе в агароз-ном геле. Ограничением данного метода является то, что изменение должно затронуть непосредственно последовательность, узнаваемую рест-риктазой. Это наблюдается довольно редко. Кроме того, чтобы выявить данный тип полиморфизма, необходимо испытать большое число рестриктаз.
Легче всего рестрикционный полиморфизм может быть найден в быстро эволюционирующих последовательностях ДНК, например, митохондриальной ДНК. На примере двух пород (темно-коричневая и серебрис-то-голубая породы) американской норки проверена эффективность 14 различных рестриктаз в отношении выявления полиморфизма (С. А. Коваленко). В одном случае удалось наблюдать межпородный рестрикци-
онный полиморфизм (фермент ВатН I) в митохондриальном геноме. При обработке митохондриальной ДНК серебристо-голубой норки рестриктазой ВатН I выявлялись два фрагмента длиной 8,95 и 7,44 тысяч пар оснований (тип А). В аналогичном случае с темно-коричневой американской норкой регистрировали два типа мт ДНК: тип А и В. Тип В характеризуется тремя фрагментами длиной 8,90, 5,42 и 2,05 тыс. пар оснований ДНК. При этом тип А отмечался у 5 животных, тип В — у 15 из исследованных 20 темно-корич-невых норок. Все 20 серебристо-голубых норок давали только тип А митохондриальной ДНК.
Таким образом, изучение рестрикционного полиморфизма митохондриальной ДНК в отдельных случаях может выявлять различия между породами у животных. Однако чаще всего обнаружить полиморфизм этим методом не удается. Необходимо применение более чувствительных к изменениям в ДНК процедур.
В настоящее время чрезвычайно широко используют технологию анализа микро- и ми-нисателлитов ДНК, позволяющую получить очень высокое разрешение, вплоть до выявления межиндивидуального полиморфизма на уровне ДНК. Следует отметить широкие перспективы использования моле-кулярно-генетических подходов в оценке биоразнообразия, изучении структуры популяций сельскохозяйственных животных и в породообразователь-ном процессе. Расчет нескольких важных популяционно-гене-тических параметров на реально существующих генофонд-ных стадах животных позволяет более осмысленно разрабатывать стратегию разведения в этих малочисленных популяциях. Определение генетических расстояний обеспечивает понимание процессов возникнове-
ния и совершенствования пород, включая и широко распространенные промышленные породы животных.
Цикл работ по анализу микро- и минисателлитной ДНК этих видов животных был проведен в течение многих лет В. П. Терлецким и Н. В. Дементьевой. Межпородную генетическую дивергенцию изучали у айрширской, черно-пестрой, голштинской и холмогорской пород крупного рогатого скота, 9 пород домашних кур, 5 пород коз, 19 пород овец. Внут-рипородную генетическую вариабельность выявляли в нескольких популяциях коз и овец, разводимых в разных географических зонах. Полученные в ходе предварительного анализа изображений данные, преобразованные в формат «0» и «1», то есть подтверждающие отсутствие или присутствие полосы в данном сегменте, анализируют в программе бе^аЬ™. В ней рассчитываются коэффициенты сходства между группами животных, средние гетерозиготно-сти и другие популяционно-ге-нетические параметры.
Картины фингерпринтинга ДНК на айрширской и холмогорской породах скота показали определенные различия по распределению полос. Так, у всех айрширских животных отмечено наличие двух общих полос, соответствующих длине фрагментов 3,5 и 3,7 тыс. пар оснований одинаковой интенсивности. Животные же холмогорской породы имели только одну общую полосу.
Наиболее подробно генетические различия между породами были изучены на примере овец. Исследования проводили в два этапа. На первом — изучили 10 популяций овец, принадлежащих к четырем породам, разводимым в Германии. Одной из редких генофон-дных пород является порода лайнешаф (лейнские овцы). Рассчитанные коэффициенты
РАЗВЕДЕНИЕ. СЕЛЕКЦИЯ, ГЕНЕТИКА
сходства указывают на генетическую близость отдельных популяций. Таким образом, было доказано предполагаемое участие овец тексель и остфризс-ких молочных в разведении отдельных стад генофондных лейнских овец. Самая низкая гетерозиготность отмечена в популяции овец породы тексель.
В следующем цикле экспериментов было использовано 19 пород овец, часть из которых находится на грани исчезновения и включена в международные программы сохранения генетических ресурсов. Определение генетических взаимоотношений в этих породах позволило прояснить отдельные вопросы реконструкции происхождения и развития пород. Например, все породы были разделены на три группы по происхождению.
Современные методы анализа ДНК позволяют выявлять генетический полиморфизм не только в длинных рестрикцион-ных фрагментах ДНК (фингер-принтинг), но и в очень коротких последовательностях ДНК, состоящих, в основном, из коротких танде
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.