БИОЛОГИЧЕСКИЕ МЕМБРАНЫ, 2008, том 25, № 6, с. 508-519
УДК 577.352
ОЦЕНКА ПЛОЩАДИ, ПРИХОДЯЩЕЙСЯ НА ОДНУ МОЛЕКУЛУ ДЕТЕРГЕНТА НА ГРАНИЦЕ РАЗДЕЛА ФАЗ В СМЕШАННЫХ ЛИПИД-ДЕТЕРГЕНТНЫХ АГРЕГАТАХ
© 2008 г. Ю. В. Храмцов, Л. И. Барсуков*
Институт биологии гена РАН, 119334 Россия, г. Москва, ул. Вавилова, д. 34/5, факс: (499)135-41-05,
электронная почта: ykhram2000@mail.ru * Институт биоорганической химии им. академиков М. М. Шемякина и Ю. А. Овчинникова РАН, 117997 Россия, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 16/10, факс: (495) 336-43-33, электронная почта: libar@mx.ibch.ru Поступила в редакцию 17.07.2008 г.
С целью теоретического анализа строения смешанных липид-детергентных и белок-детергентных агрегатов, а также изучения межмолекулярных взаимодействий в этих агрегатах разработан новый подход к оценке площади, приходящейся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз, ad, основанный на рассмотрении взаимосвязи между геометрическими параметрами упаковки детергентных и липидных молекул и составом смешанных агрегатов. Описание структурных переходов между агрегатами различного типа проведено на основе концепции параметра молекулярной упаковки, 5, обобщенного для случая двухкомпонентной липид-детергентной системы (Goltsov A.N., Barsukov L.I. // J. Biol. Phys. 2000. V. 26. P. 27-41). Показано, что в рамках этой концепции эффективный параметр упаковки 5кр, определяется соотношением детергент/липид, необходимым для полной солюбилизации
Т-, sol
смешанных агрегатов, Re , площадью, приходящейся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз, ad, а также рядом других параметров молекулярной упаковки, зависящих от строения детергента и липида. Рассчитанные с помощью предлагаемого подхода значения ad достаточно хорошо совпадают с имеющимися в литературе экспериментальными данными. Показано, что этот подход позволяет эффективно оценивать влияние на величину ad состава среды, температуры и строения детергента в широком диапазоне температур и соотношений детергент/липид. Проанализированы условия, при которых происходит насыщение липидного бислоя детергентом на начальных этапах солюбилизации. Установлена взаимосвязь между Reo1 и соотношением детергент/липид, необходимым для насыщения липидного бислоя детергентом, Reat; предложен способ оценки этого параметра с
sol
использованием имеющихся в литературе значений Re .
Знание процессов структурообразования в смешанных липид-детергентных системах необходимо для проведения солюбилизации и реконструкции мембран, выделения и кристаллизации мембранных белков [1], изучения их структуры методом ЯМР [2], а также для создания новых систем доставки лекарственных препаратов [3]. С це-
Сокращения: DMPC - димиристоилфосфатидилхолин, DPPC -дипальмитоилфосфатидилхолин, СцЕт - алкильный эфир по-лиэтиленгликоля (n - число атомов углерода в алкильной цепи детергента, m - число оксиэтиленовых звеньев), OG - октил-глюкозид, DM - додецилмальтозид, SOS - октилсульфат натрия, SDeS - децилсульфат натрия, SDS - додецилсульфат натрия, DeTABr - децилтриметиламмонийбромид, DTABr - доде-цилтриметиламмонийбромид, TTABr - тетрадецилтриметилам-монийбромид, HTABr - гексадецилтриметиламмонийбромид, MEGA-8 - октаноил-К-метилглюкамид, MEGA-9 - нонаноил-N-метилглюкамид, MEGA-10 - деканоил-К-метилглюкамид, ККМ - критическая концентрация мицеллообразования.
лью выявления общих закономерностей процесса структурообразования широко используются теоретические подходы к описанию структурного поведения липид-детергентных систем [4—10]. В частности, предпринимаются попытки теоретического предсказания условий формирования липид-детергентных агрегатов разного типа [6]. Равновесное строение липид-детергентных агрегатов определяется спонтанной кривизной липид-детергентного монослоя. Изучая зависимость этой кривизны от состава смеси и температуры, можно описать структурные переходы, происходящие в смешанных липид-детергентных системах [5-10]. Одним из параметров, задающих спонтанную кривизну монослоя, является площадь, приходящаяся на одну молекулу детергента на границе раздела фаз, а<1 [5, 6]. Знание этой площади необходимо для понимания характера межмолекулярных взаимодействий в смешанных липид-детергентных агрега-
тах [4] и принципов связывания липидов и детергентов с интегральными мембранными белками [11]. В частности, зная значения ал, можно оценить площадь гидрофобной поверхности мембранных белков, даже если структура этих белков еще не известна [11, 12].
Параметр аа обычно оценивают по данным малоуглового рассеяния рентгеновских лучей в смешанных липид-детергентных бислоях при низком содержании воды [13, 14]. Однако дефекты упаковки молекул в таких бислоях могут оказывать довольно сильное влияние на измеряемые величины аа [13]. Кроме того, результаты измерений ал, которые проводятся при низком содержании воды, вообще говоря, могут оказаться неприемлемыми для разбавленных водных систем, где площадь, приходящаяся на молекулу детергента, может быть совершенно иной.
Кроме метода малоуглового рентгеновского рассеяния площадь, приходящуюся на молекулу детергента на границе раздела фаз, можно оценить, проводя измерения в мономолекулярных пленках [15-17]. Однако при этом определяется минимальная площадь, которая приходится на молекулу детергента в условиях плотно сжатого монослоя, а она также может значительно отличаться от площади, занимаемой детергентом на поверхности липид-детергентных агрегатов. Величину ал можно оценить также с помощью резонансного переноса энергии возбуждения между флуоресцентными метками [18]. Однако данный метод требует флуоресцентно меченных детергентов и зачастую дает завышенные значения площади. Это связано с тем, что в данном случае приходится проводить измерения при низких соотношениях детергент/липид, а относительная ошибка определения ал обратно пропорциональна этому соотношению [18]. Другие ограничения существующих методов определения ал связаны с тем, что они требуют больших затрат времени и позволяют определять значение ал только в случае бислойной упаковки липид-детергентных агрегатов в узком диапазоне температур. Очевидно, что для смешанных липид-детергентных агрегатов с высокой кривизной поверхности, таких как мицеллы, эти методы могут найти лишь ограниченное применение.
Строение липид-детергентных агрегатов можно описать, используя геометрические упаковочные параметры липида и детергента [5-10]. Другой важный параметр для характеристики этих агрегатов - мольное соотношение детергент/липид в смешанных агрегатах, Яе, который используют при описании структурного и фазового поведения липид-детергентных систем [19]. Обычно предполагается, что Яе отвечает равновесному состоянию липид-детергентных агрегатов [19]. Ранее была установлена связь упаковочных параметров липида и детергента с ^ на основе концепции параметра
молекулярной упаковки 5, обобщенного для случая двухкомпонентной липид-детергентной системы [5, 6] (подробное описание его приведено в разделе "Результаты и их обсуждение"). В настоящей работе эффективный параметр упаковки использован для описания смешанных липид-детергентных агрегатов в условиях их насыщения детергентом, когда в липид-детергентной системе имеет место переход мицеллы-везикулы. В этих граничных условиях эффективный параметр упаковки имеет строго заданные значения, что позволяет, зная состав липид-детергентных агрегатов, оценивать упаковочные параметры липида и детергента. Большинство упаковочных параметров, кроме площади, приходящейся на молекулу детергента на границе раздела фаз, можно оценить, исходя из строения детергента и липида. Площадь, приходящуюся на одну молекулу липида, можно оценить по литературным данным. И тогда, зная состав ли-пид-детергентных агрегатов, можно получить искомую площадь одной молекулы детергента на границе раздела фаз, ал.
Термочувствительные липид-детергентные системы являются очень эффективной и удобной моделью для изучения структурного перехода мицеллы-везикулы [20, 21]. Ранее мы детально описали термоиндуцируемые структурные и фазовые переходы, происходящие в системе димиристоил-фосфатидилхолин-холат натрия [22], и показали, что эти переходы могут быть использованы для определения состава липид-детергентных агрегатов [23]. В настоящей работе этот подход был применен для определения аа.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали синтетические DMPC и DPPC, алкильные эфиры полиэтиленгликоля с общей формулой CnEm (n — число атомов углерода в алкильной цепи детергента, m — число оксиэтиле-новых звеньев) — C12E7, C^Eg, C^Eg, C^Eg, и NaCl фирмы "Sigma" (CffiA), трис фирмы "Serva" (Германия) и воду, очищенную с помощью системы очистки Milli-Q фирмы "Millipore" (CffiA) до сопротивления 18 МОм.
Для приготовления смесей использовали 10 мМ трис-НО-буфер (рН 7.3—7.4), содержащий 100 мМ NaCl. Липид-детергентные образцы готовили путем смешивания аликвот концентрированных растворов (дисперсий) детергента (100 мМ) и липида (50 мМ) в нужных пропорциях и разведения буфером до требуемых концентраций.
Для приведения образцов в исходное равновесное состояние. их нагревали при 50—60°C в течение 30—50 мин, затем охлаждали до комнатной температуры и выдерживали при этой температуре не менее 20 мин. Для образцов, приготовленных таким образом, температуры характерных измене-
А
450
20
40
60
t, °C
Рис. 1. Кривые турбидиметрии для системы ЭМРС-С12Е8 в зависимости от концентрации детергента в смеси. Концентрация липида 5 мМ. Концентрации детергента: 2 (7), 4 (2) и 10 мМ (3). Стрелками показана температура начала роста оптической плотности смеси, *п.
t °C 60
40
20
10
20
30
cC E , мМ
Рис. 2. Зависимости температуры начала роста оптической плотности смеси, £п, от концентрации детергента сс Е в смеси для изученных систем РС-СпЕт. Концентрация липида 5 мМ. Показаны системы: ЭРРС-С12Е8 (7), ЭМРС-С12Е8 (2), ЭМРС-С12Е7 (3), ЭМРС-С14Е8 (4) и ЭМРС-С16Е8 (5).
ний оптической плотности различались не более чем на 1°С при повторных температурных сканированиях.
Турбидиметрические измерения в режиме сканирования по температуре проводили при д
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.