МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № б, с. 927-938
ГЕНОМИКА. ^^^^^^^^^^^^^^ ТРАНСКРИПТОМИКА
УДК 577.218
ОЦЕНКА ПРИГОДНОСТИ РЕФЕРЕНСНЫХ ГЕНОВ ДЛЯ НОРМАЛИЗАЦИИ В КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ У ХЛОПКОВОЙ СОВКИ Helicoverpa armigera#
© 2014 г. G. Sharath Chandra1*, R. Asokan1*, M. Manamohan1, N. K. Krishna Kumar2, T. Sita3
1Division of Biotechnology, Indian Institute of Horticultural Research (IIHR), Hesaraghatta Lake (PO), Bengaluru, 560 089, India 2Division of Horticulture, Krishi Anusandhan Bhawan, II, New Delhi, 110 012, India 3Department of Biotechnology, St. Martin's Engineering College, Kompally, Hyderabad, 500 030, India
Поступила в редакцию 24.04.2014 г.
Принята к печати 02.06.2014 г.
Обратная транскрипция и последующая количественная ПЦР в реальном времени (RT-qPCR) — чувствительный метод, который в настоящее время широко используется для количественной оценки экспрессии генов. Однако метод требует нормализации результатов с подходящим референсным геном (RG), что имеет важнейшее значение для минимизации различий, связанных с приготовлением образцов. Информации о подходящих RG не хватает и в целом, и тем более относительно насекомых, в том числе и для хлопковой совки Helicoverpa armigera — экономически значимого вредителя. Как потенциальный инструмент для контроля над этим вредителем рассматривается технология РНК-интерференции (РНЮ), которая основана на доставке двухцепочечной РНК (дцРНК) в клетки и на точной количественной оценке умолкания (сайленсинга) соответствующих генов. В данном исследовании мы оценили пригодность пяти потенциальных RG, а именно: ß-актина (ACTB), 18S рРНК (18S), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогена-зы (GAPDH), ß-тубулина (TUB) и фактора элонгации-1 альфа (EF1-a) — для изучения генной экспрессии у H. armigera при действии дцРНК и на различных этапах развития организма и составили их ранжированные списки с помощью программного обеспечения geNorm, NormFinder и BestKeeper. Выявлено, что в экспериментах по РНЮ лучше использовать одни RG, а при исследовании стадий развития другие — в первом случае наиболее стабильно экспрессируются гены 18S и GAPDH, в то время как во втором TUB и GAPDH. Нами показано, что выбор неподходящего RG приводит к ошибочной оценке экспрессии целевого гена — в данном случае химотрипсина. Полученные результаты позволят проводить точную оценку экспрессии генов H. armigera.
Ключевые слова: Helicoverpa armigera, РНК-интерференция, экспрессия генов, ПЦР в реальном времени, референсный ген, нормализация.
EVALUATION OF REFERENCE GENES FOR QUANTITATIVE REAL-TIME PCR NORMALIZATION IN COTTON BOLLWORM, Helicoverpa armigera, by G. Sharath Chandra1*, R. Asokan1*, M. Manamohan1, N. K. Krishna Kumar2, T. Sita3 (1Division of Biotechnology, Indian Institute of Horticultural Research (IIHR), Hesaraghatta Lake (PO), Bengaluru, 560 089 India; ^Division of Horticulture, Krishi Anusandhan Bhawan, II, New Delhi, 110 012 India; 'Department of Biotechnology, St. Martin's Engineering College, Kompally, Hyderabad, 500 030 India; *e-mail: sharathgsc@gmail.com; asokaniihr@gmail.com). Reverse-transcription quantitative real-time PCR (RT-qPCR), a sensitive technique is being extensively employed in quantification of gene expression. However this requires normalization with suitable reference gene (RG) which is crucial in minimizing inter sample variations. Information regarding suitable RG is scarce in general and more so in insects, including the cotton bollworm, Helicoverpa armigera, an economically important pest. In management of this pest RNA interference (RNAi) is perceived as a potential tool, which is achieved by double-stranded RNA (dsRNA) delivery. These studies demand accurate quantification of gene silencing. In this study we assessed the suitability of five RGs viz. p-actin (ACTB), 18S rRNA (18S), glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase (GAPDH), p-tubulin (TUB) and elongation fator-1-alfa (EF1-a) for gene expression studies in dsRNA treatment and across different developmental stages of H. armigera and ranked using geNorm, NormFinder and BestKeeper software programs. Data analysis revealed that best ranked RGs were varied in dsRNA treatment and in developmental stages. Under dsRNA treatment, 18S and GAPDH were more stable whereas, TUB and GAPDH were more stable across developmental stages. We also demonstrate that in-
# Статья представлена на английском языке.
* Эл. почта: sharathgsc@gmail.com; asokaniihr@gmail.com
appropriate selection of RG led to erroneous estimation of the target gene, chymotrypsin, expression. These results facilitate accurate quantification of gene expression in H. armigera.
Keywords: Helicoverpa armigera, RNA interference, gene expression, real time PCR, reference gene, normalization.
DOI: 10.7868/S0026898414060159
ВВЕДЕНИЕ
Совка хлопковая Helicoverpa armigera — прожорливый вредитель, поражающий более 100 сельскохозяйственных культур и приносящий убытки мировой сельскохозяйственной продукции на сумму более 5 млрд. долларов США ежегодно [1, 2]. Борьба с этим вредителем была непростой на протяжении многих лет из-за его высокой приспособляемости и быстрого развития устойчивости к различным классам инсектицидов и к токсинам Bacillus thuringiensis (Bt-токсинам) [3, 4]. В связи с этим становится очень важным изучение альтернативных стратегий борьбы с вредителем, и технология РНК-интерференции (PHKi) одна из них. Этот метод имеет большой потенциал как для контроля численности этого вредителя [5], так и в исследованиях по функциональной геномике при выяснении функций впервые идентифицированных генов-мишеней [6]. PHKi реализуется с помощью доставки подходящих дцРНК. Однако прежде, чем использовать технологию PHKi для эффективной борьбы с вредителем, необходимо выявить потенциальные мишени, на которые ее следует нацелить. А для этого необходимо иметь точный количественный расклад по экспрессии генов-мишеней на разных стадиях развития вредителя.
Для оценки экспрессии генов-мишеней широко используется метод обратной транскрипции с количественной ПЦР (RT-qPCR) — благодаря простоте выполнения, чувствительности и использованию небольших количеств образца [7]. Однако точность количественной оценки в большой степени определяется различиями в количестве и качестве образцов, взятых для анализа. Избежать влияния этих различий можно только при условии, что экспрессию оценивали с использованием подходящего внутреннего контроля — ре-ференсного гена (RG) [8]. В идеале RG должен экспрессироваться единообразно на различных стадиях развития организма и при различных воздействиях [9]; однако среди ученых крепнет убеждение, что не существует универсального RG, экспрессия которого была бы стабильной при всех возможных экспериментальных условиях [10—12]. Между тем, нормализация экспериментальных данных с использованием неподходящего RG может привести к неточной оценке и неверной интерпретации результатов RT-qPCR. Таким образом, требуется идентификация тех RG,
которые имеют стабильную экспрессию при заданных условиях обработки и на изучаемых стадиях развития [8, 13, 14]. Для некоторых видов насекомых уже проведена оценка стабильности экспрессии и пригодности RG для нормализации данных по генной экспрессии [15—17], но для H. armigera такой информации нет.
В данном исследовании мы задались целью идентифицировать подходящие RG для H. armigera в условиях системы PHKi (обработка дцРНК) и на разных стадиях развития насекомого. Показано, что для разных экспериментальных условий ранжированный список возглавляют разные RG, а использование несоответствующего RG для нормирования полученных результатов может привести к их неверной интерпретации.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Гены-кандидаты. Пять эндогенных генов, а именно ACTB, 18S, GAPDH, TUB и EF1-a, выбраны нами как возможные кандидаты на роль RG. Эти гены принято использовать в качестве RG при анализе экспрессии генов насекомых [12, 18—20]. Стабильность экспрессии вышеперечисленных потенциальных RG оценивали для H. armigera в условиях PHKi (обработка дцРНК) и на различных стадиях развития (без воздействия дцРНК). В данной работе мы подтвердили, что экспрессия RG изменяется при воздействии дцРНК — для этого в качестве нормировочного контроля использована РНК халь-кон-изомеразы (CHI, фермента, участвующего в биосинтезе флавонолов томатов [21]), так называемая "spike-in" РНК. Кроме того, мы оценивали уровень экспрессии химотрипсина (целевого гена) при воздействии дцРНК, используя для нормирования результатов исследуемые потенциальные RG.
Выбор праймеров и их проверка. С помощью программного обеспечения Beacon Designer 7 ("Premier Biosoft International", www.premierbio-soft.com) для всех вышеупомянутых RG были разработаны праймеры. Не рассматривались такие наборы, для которых было предсказано формирование праймер-димеров или для продуктов амплификации формирование шпилек. Специфичность связывания каждого праймера теоретически подтверждали, используя NCBI-BLAST против доступных последовательностей, относящихся к H. armigera. Размер продукта количественной ПЦР находился в диапазоне 90—120 п.н.
для всех исследуемых генов, а температура отжига праймеров попадала в диапазон от 59 до 64°C (Приложение, табл. S1; см. дополнительные материалы на сайте www.molecbio.com/downloads/2014/ 6/supp_Sarath Chandra_rus.pdf). С целью подтвердить, что получен единственный продукт реакции, проводили анализ кривой плавления, а также электрофорез продуктов количественной ПЦР в 2.0%-ном агарозном геле (с предварительным окрашиванием бромистым этидием). Кроме того, специфичность ампликонов оценивали секвенированием клонов, содержащих продукты количественной ПЦР.
Насекомые. Только что вышедшие из яйца личинки H. armígera получены в Научно-исследовательских лабораториях биологического регулирования численности вредителей сельского хозяйства Индии (Bio Control Research Laboratories, BCRL, Pest Control of India Ltd., Бангалор). Их содержали на полусинтетической питательной среде на основе нута при температуре 27 ± 2°C и относительной влажности 65 ±
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.