ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.26
ОЦЕНКА ПРИМЕНИМОСТИ МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКОГО МЕТОДА МАЛДИ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ВНУТРИПОПУЛЯЦИОННЫХ
ДИССОЦИАНТОВ БАКТЕРИЙ
© 2015 г. Н. А. Кряжевских1, Н. Г. Лойко1, *, Е. В. Демкина1, А. Л. Мулюкин1, А. Т. Лебедев2, А. М. Гапонов3, 4, А. В. Тутельян3, 4, Ю. А. Николаев1, Г. И. Эль-Регистан1
Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва 2Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова 3ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, Москва 4ФГБУ Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии им. Дмитрия Рогачева МЗ РФ, Москва Поступила в редакцию 10.10.2014 г.
Проанализирована применимость масс-спектрометрического метода МАЛДИ для дифференциации внутрипопуляционных фенотипических диссоциантов (колониально-морфологических и (а)вирулентных вариантов) сапротрофных и условно-патогенных бактерий 5 родов (Acinetobacter, Arthrobacter, Rhodococcus, Corynebacterium, Escherichia). Анализ МАЛДИ спектров (на матрицах SA и HCCA) включал: (1) определение сходства спектров белков как долю (%) общих пиков белков от количества всех белков, что отражает филогенетическое родство объектов и рекомендуется рядом авторов для идентификации близкородственных видов; а также (2) сравнение интенсивности общих пиков и (3) наличие специфичных пиков как детерминирующие характеристики диссоциантов. Показано, что в стандартных условиях проведения анализов в ряду род—вид—штамм—диссоциант сходство МАЛДИ-профилей увеличивается. Для дифференциации диссоциантов, особенно имеющих профили, обладающие высоким сходством, наиболее применимой оказалась оценка интен-сивностей общих пиков. Отмечено, что диссоцианты (A. oxydans К14) с одинаковым морфотипом колоний (или/или S, R, M и Sm) при развитии на разных средах (LB-агар, TSA, TGYg) имели различия в белковых профилях, что отражало различия в их физиологических свойствах. Это согласуется с ранее опубликованными нами результатами скрининга диссоциантов R. opacus, обладающих при одинаковой морфологии колоний разной субстратной специфичностью в разложении хлорфенолов. Для таких диссоциантов анализ их МАЛДИ-спектров является, по-видимому, единственным эффективным методом детекции.
Ключевые слова: MALDI-TOF MS, микроорганизмы, диссоцианты, идентификация.
DOI: 10.7868/S002636561503012X
Метод MALDI-TOF MS (матрично-активиро-ванной лазерной десорбционно-ионизационной (МАЛДИ) время-пролетной масс-спектромет-рии) все шире начинает применяться для решения ряда задач систематики микроорганизмов: разграничения организмов близких геномовидов, предварительной идентификации новых феноти-пически близких изолятов, идентификации и классификации бактерий на уровне вида и подвида [1—6]. Метод основан на масс-спектрометри-ческом анализе количественного распределения осколков белковых молекул в зависимости от их массы (m/z). Преимуществами метода являются:
* Автор для корреспонденции (e-mail: loikonat@mail.ru).
быстрота анализа, малое количество анализируемых клеток и, что наиболее важно, возможность получить информацию не о потенциальных, заложенных в геноме, а проявляющихся в конкретных условиях свойствах микроорганизмов, которые реализуются посредством экспрессирующихся белков [7]. В зависимости от применяемых матриц МАЛДИ-спектр бактерии выявляет качественный и количественный состав микробных белков в диапазоне масс 2000—20000 m/z, в том числе, рибосомных. Рибосомные белки составляют около 20% от массы всех белков клетки и порядка 3% от всей клеточной массы, при этом они специфичны для организма, развивающегося в разных условиях, и поэтому могут использоваться
в качестве биомаркеров для целей филогенетического анализа [4, 5]. Отметим, что эффективность использования белковых профилей клеток, как и других хемодиагностикумов, зависит от стандартизации условий анализа (условий роста микроорганизмов, пробоподготовки образцов, используемых матриц и др.) и программного обеспечения (выявления характеристических белковых пиков, определения границ принадлежности бактерии к определенной иерархической структуре, создания на их основе баз данных) [1, 7, 8]. При стандартизации условий анализа применение метода перспективно для быстрой таксономической диагностики (совокупно с другими методами) [9, 10], в том числе дифференциации бактерий близких видов [3] и штаммов одного вида [11].
Однако о возможности детекции методом МАЛДИ объектов еще более низкого ранга, реализующихся в рамках одного генома в виде внут-рипопуляционных вариантов (диссоциантов), на сегодняшний день имеются лишь единичные сообщения [9]. Вместе с тем известно, что механизмы фенотипической изменчивости включают вариацию состава синтезируемых белков [12], что будет отражаться на белковых спектрах диссоциантов. Это дает основания для развития такого перспективного направления применения МАЛДИ-анализа, как детекция диссоциантов, что важно для индикации реактивированных и некультивируемых форм бактерий, вирулентных, токсикогенных и патогенных штаммов в целях санитарного мониторинга, а также скрининга высокоэффективных биотехнологических продуцентов [6, 9, 13—15].
Целью работы было изучить применимость масс-спектрометрического метода МАЛДИ для дифференциации внутрипопуляционных колониально-морфологических диссоциантов сапро-трофных и условно-патогенных бактерий, а также оценить информативность МАЛДИ-профилей для однотипных колониально-морфологических диссоциантов, развивающихся на различных по составу средах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследования служили бактерии: Acinetobacter lwoffii ЕК30А, Arthrobacter oxydans. К14, Arthrobactersulfonivorans К15, выделенные из образцов мерзлых подпочвенных отложений [16]; Acinetobacter lwoffii BSW-27 (коллекция Саратовского ГМУ), Corynebacterium pseudodiphtheriticum 090497 (коллекция ФГБУН ГНИИ СКМБП), Rhodococcus opacus 1ср (коллекция ФГБУН ИБФМ РАН), E. coli MG 1655 (коллекция ФГБУН ИМГ РАН), а также мутантный штамм Escherichia coli dsp 250, содержащий на плазмиде вставку генов fimA и lacZ под общим промотором, диссоци-анты которого различались способностью фор-
мировать пили 1 типа, ассоциированные с вирулентностью бактерий.
Для культивирования бактерий использовали стандартные и разбавленные жидкие и агаризо-ванные (1.5% агара) среды: LB ("Carl Roth GmbH", Германия); TSB ("Panreac", Испания); TGY (г/л: дрожжевой автолизат — 3; триптон — 5; глюкоза — 1). Бактерии культивировали при 28°С в колбах объемом 250 мл (50 мл среды) на роторной качалке (140—160 об/мин). Инокулят — культуру начала стационарной фазы, вносили в количестве, обеспечивающем начальную оптическую плотность (ОП) 0.2 (X = 540 нм, l = 10 мм, Specord UV VIS, "Carl Zeiss Jena", Германия).
Колониеобразующую способность клеток (КОЕ/мл) определяли высевом разведенных (10N раз) бактериальных суспензий на чашки с плотными (1.5% агара) агаризованными средами.
Диссоцианты различающихся колониально -морфологических типов получали при рассеве аликвот бактериальных культур различного физиологического возраста, а также покоящихся форм (ПФ) на агаризованные (1.5% агара) среды LB, TSA, TSA/2 и TGYg (с увеличенным в 10 раз содержанием глюкозы — 10 г/л). Диссоцианты E. coli dsp 250, различающиеся способностью формировать пили 1 типа, получали при рассеве штамма на среде LB с красителем X-gal.
Покоящиеся формы бактерий получали в постстационарных культурах (до 4 мес.), развивающихся в условиях, имитирующих природные, как описано ранее [17, 18]. Покоящиеся формы арт-робактеров получали при развитии: (1) ПФП — в полноценной среде LB и хранении выросшей культуры при 28°С в течение 2 мес.; ПФN — в среде, лимитированной по азоту, и хранении при 4°С в течение 2 мес.; ПФФ — при дисбалансе фосфора и хранении при 28°С в течение 2 мес. [19]; ПФ ро-дококков — как описано в [20]; ПФ псевдодефте-рии — как описано в [21].
Протеомный анализ вегетативных клеток диссоциантов бактерий масс-спектрометрическим методом МАЛДИ (мatrix-assisted laser-desorption/ion-ization time-of-flight mass spectrometry) проводили по методу [22] в модификации [3]. Образцы клеток погруженных культур получали, отбирая аликвоты культуры определенного возраста, клетки отделяли цнтрифугированием (5000 g, 15 мин), дважды промывали физиологическим раствором, осадок клеток собирали и использовали для анализа. Клетки погруженных культур или выросшие на плотных средах колонии (~10 мг сухой биомассы) диссоциантов бактерий определенного колониально-морфологического типа (S, R, M, D, Sm) стерильно снимали с агаризованной среды и переносили в раствор (50 мкл) свежеприготовленного 50% ацетонитрила ("Sigma"), содержащего 2.5% трифторуксусной кислоты (ТФУК), переме-
шивали. Полученную суспензию (1 мкл) смешивали с раствором матрицы (1 мкл), в качестве которой использовали синапиновую (SA) и а-циа-но-4-гидроксикоричную (HCCA) кислоты в 50% растворе ацетонитрила в 0.1%-ной водной ТФУК, и высушивали на пластинке-мишени при температуре 18—20°С. Спектры регистрировали в линейном режиме с задержанной экстракцией ионов на приборе Autoflex II ("Bruker Daltonics", Германия) (с азотным лазером, X = 337 нм, время-пролетным анализатором и рефлектроном). Запись спектров проводили в режиме положительных ионов; диапазон регистрируемых масс бактериальных белков составлял 2—20 кДа. Результирующие спектры каждого препарата штаммов получали суммированием спектров, зарегистрированных в 10 точках анализируемых препаратов при 50 ударах лазера. Обработку масс-спектров проводили с помощью программных пакетов Flex analysis 2.2 и Biotyper 2.0 ("Bruker Daltonics", Германия).
Анализ белковых МАЛДИ-профилей осуществляли сопоставлением пиков с указанием m/z (масса/заряд, z — обычно ±1), интенсивности, относительной интенсивности (по отношению к максимальному пику) и уровня шума — S/N (сигнал/шум). Для сравниваемых объектов выявляли долю общих и специфичных пиков, сравнивали их по относительной интенсивности (далее — интенсивность). Пики разных спектров считали одинаковыми, если разница между ними
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.