РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2013, том 53, № 3, с. 280-289
МОДИФИКАЦИЯ РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК [57+61]:539.1.047:591.111.1:599.742.13
ОЦЕНКА ПРОТИВОЛУЧЕВОЙ ЛЕЧЕБНОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ РЕКОМБИНАНТНОГО ТРОМБОПОЭТИНА НА СОБАКАХ ПО КРИТЕРИЯМ ПОКАЗАТЕЛЕЙ КРОВЕТВОРЕНИЯ И ВЫЖИВАЕМОСТИ
© 2013 г. Л. М. Рождественский*, Т. Г . Шлякова, Р. А. Щеголева, Н. И. Лисина, В. В. Зорин
Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России, Москва
Объектом исследования было изучение в экспериментах на собаках эффективности рекомбинант-ного человеческого тромбопоэтина (рчТПО) в качестве средства экстренного патогенетического лечения острой лучевой болезни. Животных подвергали острому облучению на у-установке "ИГУР" (мощность дозы 1.6—1.85 сГр/с) в дозах 3.5 (>ЛД95/45) и 3 Гр. Собаки всех групп, включая контрольных, получали поддерживающую антибиотикотерапию в период разгара острой лучевой болезни (7—21 сут). Однократное подкожное или внутривенное введение рчТПО в дозе 10 мкг/кг (но не 5 мкг/кг) через 1.5—2 ч после облучения оказало лечебное действие как по показателю выживаемости, так и по показателям крови. Особенно выраженный эффект был зарегистрирован в отношении тромбопоэза, но также, хотя и в меньшей степени, в отношении грануло- и лимфопоэза. Полученные результаты, несмотря на малочисленность использованных в опытах с ТПО животных, позволяют считать перспективной разработку данного цитокина в качестве средства экстренной противолучевой терапии и средства борьбы с постлучевыми тромбоцитопениями.
Острое лучевое поражение, средства экстренной терапии, цитокины, тромбопоэтин. БОТ: 10.7868/80869803113030090
Разработка средств экстренной и ранней терапии/модификации острых лучевых поражений остается актуальной, несмотря на редкость таких поражений. В арсенале средств лечения лучевых поражений лидирующее положение наряду с консенсусной поддерживающей терапией занимают различные цитокины [1—4].
Из группы цитокинов по способности оказывать противолучевое действие при введении в самые ранние сроки после радиационного воздействия (в пределах 2—3 ч) выделилась подгруппа провоспалительных цитокинов, в связи с чем они были обозначены как препараты экстренной противолучевой терапии [5—9]. Из этой подгруппы детально проработан и разрешен для лечения человека при аварийных радиационных воздействиях лишь рекомбинантный человеческий интерлей-кин-1р — беталейкин [6—9]. Несколько позже по сравнению с первыми результатами исследований провоспалительных цитокинов появились данные о том, что сходным с беталейкином экстренным противолучевым действием обладает рекомби-нантный человеческий тромбопоэтин — рчТПО [10—11]. Это было несколько неожиданно, так как
* Адресат для корреспонденции: 123182 Москва, ул. Живописная, 46, Федеральный медицинский биофизический центр им. А.И. Бурназяна ФМБА России; тел.: (499) 19095-54; e-mail: lemrod@mail.ru.
ТПО рассматривался как чисто линиеспецифиче-ский препарат узконаправленного действия, только на предшественники тромбоцитов. Однако эа-тем было показано, что тромбопоэтин действует не только на мегакариоцитарный, но и на гранулоци-тарный и эритроидный ростки, благодаря чему он оказался способным спасать мышей от гибели при облучении в летальных дозах [11—12]. В опытах на облученных в дозе 5 Гр обезьянах ТПО в комбинации с гранулоцитарным (Г-) или гранулоци-тарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором (ГМ-КСФ) ускорял восстановление всех ростков кроветворения, а также восстановление численности популяции CD34+ клеток костного мозга [13]. Было высказано предположение, что в основе противолучевого действия ТПО может лежать его способность ингибировать радиационный апоптоз [14].
ТПО представляет собой полипептид с молекулярной массой 95 кДа, который синтезируется в печени и является основным физиологическим регулятором мегакариоцитопоэза и производства тромбоцитов в организме млекопитающих, включая человека [15]. ТПО состоит из двух доменов, один из которых связывается с рецептором с-Мр1 и демонстрирует высокую степень гомологии с эритропоэтином, а другой представляет собой вы-сокогликозилированный углеводород с карбок-
сильным концом. Так как влияние на мегакарио-цитопоэз идет через рецептор c-Mpl, то часто встречается такое название тромбопоэтина как c-Mpl лиганд. Помимо основной функции регулятора тромбопоэза тромбопоэтин оказывает влияние на продукцию примитивных плюрипотентных стволовых клеток и предшественников других клеточных линий кроветворения.
После клонирования тромбопоэтина появилось несколько рекомбинантных тромбопоэти-нов (продуцируемых с участием пересаженного в культивируемую клетку гена человеческого ТПО). Существуют две основные их формы: ре-комбинантный человеческий тромбопоэтин (рчТПО, rhTPO) либо педжилированный (связанный с полиэтиленгликолем — ПЭГ) рекомби-нантный человеческий мегакариоцитарный ростовой и дифференцирующий фактор (ПЭГ-рч МРДФ, PEG-rHuMGDF). Обе формы рекомби-нантного тромбопоэтина сходны по своим фармакологическим свойствам.
Для продуцирования рчТПО используется эу-кариотическая или прокариотическая клетка. В первом случае он гликозилирован, а его молекулярная масса составляет 80 кДа, во втором случае — негликозилирован, с молекулярной массой 18 кДа. ПЕГ-рч МРДФ является более сложным продуктом. Его домен, связывающийся с рецептором c-Mpl и имеющий молекулярную массу порядка 17—18 кДа, продуцируется в прокариотиче-ской клетке, а затем после выделения связывается с полиэтиленгликолем с массой 20 кДа. Последний увеличивает продолжительность циркуляции всей молекулы в крови.
Задачей настоящей работы было изучение возможностей рчТПО как средства экстренной терапии в опытах на собаках, еще не опробованном для данного препарата виде крупных лабораторных животных. При проведении экспериментов на собаках использовали наименьшие, из представленных в литературе, дозы тромбопоэтина — 5 и 10 мкг/кг. Наиболее важным при этом представлялось влияние препарата на тромбопоэз, а не на выживаемость животных. В аспекте интересов практики особый интерес заключался в оценке эффективности однократного введения ТПО.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Использовали рекомбинантный человеческий тромбопоэтин (ТПО human) фирмы "Prospec-Tany TechnoGene Ltd". Он синтезируется в клетках яичника китайского хомячка, в которые внедрен человеческий ген ТПО. Пептидная часть препарата состоит из 332 аминокислотных единиц с мол. массой приблизительно 35 кДа, которая после гликозилирования возрастает до примерно 80 кДа. Препарат поставляется в лиофилизиро-
ванной форме и хранится при температуре ниже —18°С. Препарат растворяли сначала в воде, затем добавляли фосфатно-солевой альбуминовый буфер, аликвоты использовали в течение 3 ч или замораживали для последующего использования.
Изучение лечебной эффективности ТПО проводили в опытах на беспородных собаках обоего пола массой от 12.5 до 19.5 кг. Животных содержали в стандартных условиях вивария ИБФ на рационе питания гранулированным кормом и при свободном доступе к воде. Животных отбирали в течение не менее месяца по критериям их общего состояния (активное поведение, стабильная масса тела, оформленный стул, ректальная температура не выше 39°С, отсутствие кожных повреждений) и устойчивых показателей крови (лейкоциты в пределах 6—14 тыс./мкл, эритроциты не менее 6 млн/мкл, СОЭ не выше 10 мм/ч). При работе с животными руководствовались соответствующими регламентирующими документами о правилах проведения экспериментов на лабораторных животных [16—18].
Облучение животных проводили на установке "ИГУР" двумя парами расположенных напротив друг друга и дистанционно управляемых цезие-вых у-излучателей при мощности дозы 1.85 и 1.6 сГр/с. Тотальное равномерное облучение с перепадами по всей массе тела не более 10% было отконтролировано дозиметрически. Собак облучали поштучно, в замкнутой и ограничивающей движение животных клетке в дозах 3.5 и 3 Гр. Через 1.5—2 ч после лучевого воздействия животным вводили внутривенно или подкожно раствор тромбопоэтина (группа лечения) или равный объем растворителя последнего — фосфатно-аль-буминовый буфер (контроль).
При обеих дозах облучения всем собакам, включая контрольных, в период разгара заболевания (7-21-е сут) назначалась по показаниям терапия антибиотиками (внутримышечно ампициллин 0.25 г и гентамицин 4% — 1 мл х 2 раза в сут). Показаниями служили повышение температуры тела выше 39.5°С и/или снижение числа лейкоцитов в периферической крови ниже 1.0 тыс./мкл, что согласуется с критериями, описанными в зарубежной литературе.
О тяжести лучевого поражения у облученных собак и противолучевой эффективности ТПО судили по общему клиническому состоянию животных в течение опыта (поведение, аппетит, стул, динамика веса, температура тела, выраженность геморрагического и кишечного синдромов — кровоизлияния в кожные покровы и слизистые, кровотечения, диарея, мелена), частоте возникновения и тяжести инфекционных осложнений (ангина, пневмония, отек лап), глубине поражения и динамике восстановления клеточных показателей периферической крови, а
Сроки после облучения, сут
Рис. 1. Динамика гибели собак, облученных в дозе 3.5 Гр: 1 — контроль, 2 — ТПО-5 мкг/кг, 3 — ТПО-10 мкг/кг.
также выживаемости и средней продолжительности жизни павших животных. Наблюдение за животными проводилось на протяжении 45 сут после облучения, в острый период — обследовали ежедневно.
Полученные в опытах результаты подвергали графической и статистической обработке с использованием компьютерных программ "Statisti-ca 6" и "Microsoft Office Excel", а также монографии по статистической обработке данных биологических исследований [19]. Достоверности различий между сравниваемыми показателями оценивали по критериям: Манна—Уитни, х2, i-Стьюдента и точному критерию Фишера.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Исследование противолучевой активности ТПО проведено на двух группах собак в условиях их тотального облучения в дозах 3 и 3.5 Гр. По данным различных исследователей, в настоящее время остается неясным вопрос об оптимальном способе введения тромбопоэтина — внутривен-
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.