ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 4, с. 462-468
^=БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.46
ОЦЕНКА РАЗЛИЧНЫХ ИНДЕКСОВ РАЗНООБРАЗИЯ ДЛЯ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЧВЕННОГО ПРОКАРИОТНОГО СООБЩЕСТВА ПО ДАННЫМ МЕТАГЕНОМНОГО АНАЛИЗА*
© 2015 г. Т. И. Чернов, А. К. Тхакахова, О. В. Кутовая
Почвенный институт им. В.В. Докучаева Россельхозакадемии, 119017, Москва, Пыжевский пер., 7
e-mail: chern-off@mail.ru Поступила в редакцию 01.09.2014 г.
Проведено сравнение применимости используемых в экологии индексов разнообразия для оценки метагеномов прокариотных сообществ почв на разных филогенетических уровнях. Рассмотрены следующие показатели: количество обнаруженных таксонов, индексы Шеннона, Менхиника, Мар-галефа, Симпсона, Chaol и ACE. Анализ разнообразия прокариотных сообществ проводили на примере верхних горизонтов чернозема типичного (Haplic Chernozem (Pachic)), темно-каштановой (Haplic Kastanozem (Chromic)) и крайнеаридной пустынной почв (Endosalic Calcisol (Yfermic)) на основе анализа 16S рРНК генов. Индексы Менхиника, Маргалефа, Chaol и ACE демонстрировали сходные результаты по разделению сообществ по уровню разнообразия, индекс Симпсона давал хорошие результаты только при анализе таксонов высокого уровня (филумов), наилучшие результаты показал индекс Шеннона. В целом все использованные индексы показывали уменьшение разнообразия в ряду чернозем-темно-каштановая—крайнеаридная пустынная почва.
Ключевые слова: биоразнообразие, почвенная микробиота, индекс Шеннона, индекс Симпсона, индекс Маргалефа, индекс Менхиника, Chaol, ACE, Haplic Chernozem (Pachic), Haplic Kastanozem (Chromic), Endosalic Calcisol (Yermic).
Б01: 10.7868/80032180X15040036
ВВЕДЕНИЕ
Разнообразие почвенной микробиоты является важным фактором биологической устойчивости почв, интенсивности и направленности многих биохимических процессов в почве и инструментом биодиагностики с широким потенциалом. Большинство данных разнообразия микроорганизмов в разных почвах получено классическими методами [2, 6], однако в последнее время все больше используют молекулярно-биологические методы [9, 10], позволяющие учесть множество некультивируемых и редких представителей почвенной микробиоты, среди которых особенное место занимают методы ме-тагеномики. Изучение почвенного метагенома основано на выделении тотальной ДНК из образца и дальнейшем секвенировании нуклеотид-ных последовательностей для их идентификации на различных таксономических уровнях. Совершенствование методов секвенирования нового поколения привело к широкому распространению метагеномики для оценки разнооб-
* Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 14-2600079.
разия микробных сообществ образцов разной природы, в том числе почв, которые являются уникальным источником генетического и фено-типического разнообразия микроорганизмов [18, 20].
Наибольшее внимание исследователей привлекает ген 168 рРНК, использующийся для определения таксономического (филогенетического) положения прокариот [21]. Полученные в результате секвенирования сходные нуклеотидные последовательности (сиквенсы) гена 168 рРНК, объединяются в операционные таксономические единицы, которые затем можно отнести к филогенетическим таксонам различного уровня — в этом состоит принцип анализа биоразнообразия в ме-тагеномике.
Для оценки разнообразия биологических сообществ применяют различные индексы — численные показатели, рассчитывающиеся на основе числа таксонов в сообществе и числа особей (в метагеномике — число сиквенсов) в разных таксонах. Стоит отметить, что разнообразие включает в себя два компонента: богатство (количество таксонов) и выравненность (относительное обилие
таксонов) [7]. Некоторые индексы разнообразия призваны объединить эти два параметра в единую
меру, позволяющую сравнивать разные сообщества по разнообразию.
В метагеномике применяют множество индексов разнообразия как классических, широко распространенных в экологии для анализа сообществ высших организмов (индексы Шеннона и Симпсона), так и довольно специфических, предложенных относительно недавно (Chaol, ACE) [8—10]. Однако, если в классической экологии хорошо известна применимость тех или иных индексов разнообразия, границы их вариабельности и т.д., то для данных метагеномики эти вопросы недостаточно ясны. Почвенный метагеном специфичен по своей структуре, характеризуется крайне высоким таксономическим разнообразием микроорганизмов [20] и, как правило, отсутствием четко выраженных доминантов на низком таксономическом уровне, поэтому некоторые классические индексы разнообразия плохо применимы для его анализа.
Одними из наиболее простых индексов разнообразия, не учитывающих относительное обилие таксонов, являются индексы Маргалефа DMg =
= ——1 и Менхиника DMn = ----- [7], для их расче-
lnN JN
та учитывают лишь число обнаруженных таксонов S и общее число особей N.
Наиболее часто используемым для характеристики разнообразия сообществ индексом является индекс Шеннона, иногда его называют индексом Шеннона—Вивера (Shannon—Weaver) или Шеннона—Уинера (Shannon—Wiener): H =
= V— PjlgPi, где Pi — относительное обилие /-го
¿—ч = 1
таксона, S — число обнаруженных таксонов. В качестве основания логарифма часто берут 2 или е, хотя приемлемо и любое другое число [7]. Для значения индекса Шеннона число таксонов является более важным фактором при S < 10, а при увеличении числа таксонов возрастает роль вы-равненности [11]. Очевидно, что в случае почвенного прокариотного метагенома, где число таксонов даже высокого уровня довольно велико, индекс Шеннона будет определяться в основном выравненностью обилий таксонов. Меру вырав-ненности на основе индекса Шеннона иногда рассчитывают особо, используя отношение наблюдаемого разнообразия к максимальному E =
H H гг,1 =- = — [7], этот индекс иногда называют
Hmax 1П—
индексом Пиелу (Pielou).
Еще одним часто используемым в экологии индексом разнообразия является индекс Симп-
где nt — число
сона, который часто определяют как вероятность принадлежности к разным таксонам двух особей, случайно выбранных из неопределенно большого сообщества [11]. Индекс Симпсона рассчитывают по формуле D = V Г —^
N - 1)_
особей в таксоне, N — общее количество особей [7]. Так как по мере увеличения выравненности таксонов величина D уменьшается, индекс Симп-сона часто используют в форме (1 — D) и называют "вероятностью межвидовых встреч" или в форме (1/D) — "обратный индекс Симпсона" или индекс полидоминантности Вильямса [11]. Оба индекса возрастают с увеличением выравненно-сти обилий таксонов в сообществе (то есть с увеличением разнообразия). Некоторые авторы отмечают, что индекс Симпсона практически полностью определяется долей 1—2 наиболее обильных видов [11], поэтому индекс Симпсона и его производные (1 — D, 1/D) можно относить к "мерам доминирования" — индикаторам доминирования одного или нескольких видов.
Самым простым способом характеристики богатства сообщества является использование количества обнаруженных таксонов (как правило, видов). Однако для почвенной метагеномики использование этого показателя затруднено, во-первых, из-за неоднозначности выбора конкретного таксономического уровня, а во-вторых, в связи с крайне большим набором видов и родов, для полного обнаружения которых может быть необходим анализ 20000 и более сиквенсов на образец [20]. В связи с этим при анализе бактериального метагенома часто используют различные оценки реального количества таксонов, например, индекс Chao1, который рассчитывают по
2
формуле Chao1 = Sobs +--[13, 15], где Sobs — обна-
2b
руженное количество таксонов, a — число таксонов, содержащих один сиквенс (singletons), b — число таксонов, содержащих два сиквенса (doubletons). Еще один показатель, оценивающий реальное количество таксонов — ACE (Abundance Coverage Estimator) [14, 19] — рассчитывают гораздо более сложным образом и используют принятый исследователем уровень обилия таксонов (как правило, равный 10 сиквенсам), разделяющий редкие и хорошо представленные таксоны. Оба показателя, Chao1 и ACE, широко применяют и оценивают как дающие хорошие результаты для анализа разнообразия [16].
Проведена попытка оценки перечисленных индексов разнообразия для характеристики почвенного прокариотного сообщества по данным пиросеквенирования и описания метагенома исследованных почв. Хорошо подходящий для дан-
ной цели индекс, по нашему мнению, должен обладать малым разбросом значений для случайных выборок, мало зависеть от размера выборки и подходить для анализа разнообразия на разных таксономических уровнях.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ
Для анализа выбрали три типа почв, обладающих высокой биологической активностью, и составляющих зональный ряд от степной до пустынной зоны. Анализировали образцы верхнего гумусово-аккумулятивного горизонта чернозема типичного (Haplic Chernozem (Pachic)) (по [5]), темно-каштановой почвы (Haplic Kastanozem (Chromic)) (по [5]) и образцы поверхностного гор. К (биокорка) крайнеаридной пустынной почвы (Endosalic Calcisol (Yermic)) (по [3], названия по WRB даны по [4], с коррекцией в соответствии с третьей редакцией WRB [17]).
Образцы чернозема типичного отобрали в Курской обл. (51 °34'27.8" N, 36°05'67.2" E), темно-каштановой почвы — в Волгоградской обл. (49°13'29'' N, 42°56'32'' E), крайнеаридной пустынной почвы — в окрестностях Тажарасу, Уйгурский район Алматинской обл. Казахстана (43°42'44.8'' N, 79°22'21.1'' E).
Образцы хранили при температуре —70°С. ДНК выделяли из 0.5 г почвы после механического разрушения с использованием стеклянных шариков в экстрагирующем буфере, содержащем 350 мкл раствора А (натрий-фосфатный буфер — 200 мМ, изоцианат гуанидина — 240 мМ, pH = 7), 350 мкл раствора Б (Трис-HCl - 500 мМ, SDS -1% по массе к объему, pH = 7) и 400 мкл смеси фенола с хлороформом (1 : 1). Разрушение образца проводили в течение 40 с при максимальной мощности (скорость 6500 об/мин) с использованием 3D-вращения на гомогенизаторе Precellys 24 (Bertin Technologies, Франция). Полученный препарат центрифугировали при максимальной скорости 16000 об./мин в течение 5 мин. Водную фазу отбирали и повторно экстрагировали хлороформом. ДНК
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.