МИКРОБИОЛОГИЯ, 2012, том 81, № 5, с. 672-681
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.266.2
ОЦЕНКА РАЗНООБРАЗИЯ АЗОТФИКСИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В РИЗОСФЕРЕ РАСТЕНИЙ СОИ МЕТОДОМ АНАЛИЗА nifH ГЕНА © 2012 г. А. К. Кизилова*, ^ Л. В. Титова**, И. К. Кравченко*, Г. А. Иутинская**
*Институт микробиологии им. С.Н. Виноградского Российской академии наук, Москва, Россия **Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАНУ, Киев, Украина
Поступила в редакцию 01.12.2011 г.
Биологическая азотфиксация составляет важную часть в балансе азота агроэкосистем и обеспечивает значительную часть азотного питания растений даже в условиях интенсивного применения удобрений. Основным приемом агробиотехнологии при выращивании сои (Glycine max (L.) Merrill) является применение микробных препаратов на основе Bradyrhizobium japonicum, и успех инокуляции в значительной степени зависит от взаимоотношений интродуцента с аборигенными ризо-сферными микроорганизмами. Для оценки состава диазотрофных сообществ проведены исследования разнообразия гена nifH, молекулярного маркера азотфиксации, в образцах ризосферной почвы сои, выращиваемой без инокуляции и с внесением бактериальных препаратов, а также в накопительных культурах диазотрофов. Все выявленные диазотрофы продемонстрировали низкий уровень сходства с известными микроорганизмами (74—95% по нуклеотидам) и были идентифицированы как представители отделов Firmicutes и Proteobacteria. Установлено доминирование в составе азотфиксирующих сообществ ризосферной почвы микроорганизмов, относящихся к Clostridium, Paenibacillus, Spirochaeta.
Ключевые слова: азотфиксация, nifH ген, молекулярная экология, ризосфера.
Микроорганизмы, фиксирующие молекулярный азот, широко распространены в почвенных биоценозах и осуществляют одно из важнейших звеньев азотного цикла, которое наряду с фотосинтезом обеспечивает продуктивность биосферы. Во многих природных экосистемах количество доступных источников азота крайне ограничено и именно процессу биологической азотфиксации принадлежит значительная роль в круговороте биогенных элементов [1].
Наиболее распространенным приемом повышения продуктивности растений и качества их урожая, позволяющим сохранять естественное плодородие почв без ухудшения экологического состояния окружающей среды, является применение биологических препаратов на основе азот-фиксирующих микроорганизмов. Использование микробных препаратов позволяет регулировать численность и активность полезной микрофлоры в ризосфере возделываемых культур, а также обеспечивать растения азотом, фиксированным из атмосферы. В почвах, на которых соя выращивается впервые, обычно отсутствуют специфичные для нее клубеньковые бактерии или же их количество незначительно [2]. Селекция новых высокоэффективных штаммов клубеньковых бактерий и подбор комплементарных растений-партнеров —
1 Автор для корреспонденции (e-mail: alegrria@gmail.com).
перспективное направление повышения эффективности симбиотической азотфиксации и продуктивности бобовых растений [3, 4]. В последние десятилетия для получения новых штаммов ризобий, наряду с аналитической селекцией, широко применяют и генно-инженерные методы [5], в том числе транспозоновый мутагенез [6].
Взаимоотношения высших растений и почвенных микроорганизмов являются одной из интереснейших и сложнейших проблем биологии. Из всех типов симбиозов микроорганизмов с растениями наиболее хорошо изучен симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями (ризобиями), что связано с его практической значимостью. Несмотря на это, наши знания о разнообразии диазотрофов в системе почва-бобовое растение остаются неполными, и существующие сведения основаны, главным образом, на результатах использовании традиционных методов культивирования. Успех инокуляции ризобиями в значительной степени зависит от выживания ин-тродуцентов в почве и их взаимоотношений с аборигенными микроорганизмами. В настоящее время ризобии рассматриваются не только как симбионты бобовых растений, но и как ассоциативные и/или эндофитные азотфиксаторы [7]. Для управления функционированием микробных сообществ необходимо оценить внутреннюю структуру системы, изучить свойства доминирующих микробных
популяций, определить порог устойчивости микробных сообществ.
Значительный прогресс в изучении биоразнообразия почвенных микроорганизмов был достигнут в связи с развитием и совершенствованием методов, основанных на анализе почвенных нуклеиновых кислот. Они включают в себя интегральные оценки, основанные на изучении кинетики процесса реассоциации ДНК [8], анализе нуклеотид-ных последовательностей таксономического маркера 16S рРНК [9] или специальных функциональных генов-маркеров [10], гибридизации in situ с флуоресцентными зондами (FISH) [11].
В последние годы опубликован ряд работ, основанных на анализе гена nifH, который является удобным филогенетическим геном-маркером для изучения азотфиксаторов в природных экосистемах. ПЦР-анализ фрагментов гена nifH был успешно применен для оценки состава азотфик-сирующих сообществ различных почв [12—19].
Целью настоящей работы было изучить разнообразие азотфиксирующих микроорганизмов ри-зосферной почвы сои при интродукции штаммов ризобий методами молекулярной экологии и микробиологии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объекты исследования. Полевые опыты были проведены в вегетационный сезон 2008 г. на Опытной станции Института агроэкологии НААН Украины в Киевской области. Описание вариантов полевых опытов приведено в табл. 1. Предпосевную обработку семян сои сорта Горлица контрольного варианта осуществляли стерильной водопроводной водой, а опытных вариантов — инокулянтами на основе высокоэффективных штаммов ризобий сои, селекционированных в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины: Bradyrhizo-bium japonicum УКМ В-6018 или B. japonicum УКМ В-6035 (моноинокулянты), композицией B. japonicum УКМ В-6018 и Bacillus megaterium УКМ В-5724 (бинарный инокулянт), а также сенсибилизированной культурой B. japonicum УКМ В-6035, полученной при культивировании ри-зобий с генистеином, сигнальным флавоноидом соево-ризобиального симбиоза, в концентрации 10-11 М ("Sigma", Германия). Бактериальная нагрузка при инокуляции составляла 107 клеток/семя.
Почва была охарактеризована как серая лесная. Агрохимические показатели в пахотном, 0— 20 см слое были следующими: содержание гумуса по Тюрину — 1.3%, рН—5.4, гидролитическая кислотность — 2.4 мг-экв/100 г почвы, содержание легкогидролизованного азота по Корнфилду — 125 мг/кг почвы, подвижного фосфора (Р2О5) по
Таблица 1. Образцы почвы полевого опыта с соей сорта Горлица, 2008 г., использованные в настоящем исследовании
№ п/п Вариант полевого опыта Характеристика
1 П 1 Контроль (без инокуляции)
2 П 2 Инокуляция B. japonicum УКМ В-6035 (71т)
3 П 3 Инокуляция B. japonicum УКМ В-6018 (2в)
4 П 8 Инокуляция B. japonicum УКМ В-6018+ Bacillus megaterium УКМ В-5724
5 П 9 Инокуляция B. japonicum УКМ В-6035 (сенсибилизированный генистеином)
Кирсанову — 220 мг/кг почвы, обменного калия (К2О) по Кирсанову — 164 мг/кг почвы.
Образцы ризосферной почвы отбирали в фазе цветения сои на делянках, различающихся по внесению бактериальных препаратов (табл. 1).
Получение накопительных культур диазотро-
фов. Для получения первичных накопительных культур диазотрофов 2 г ризосферной почвы вносили в конические колбы объемом 500 мл, содержащие 200 мл безазотной минеральной среды Эш-би с маннитом. Инкубацию вели под ватно-марле-выми пробками без перемешивания при +28°С в течение 7 суток.
Выделение ДНК из почвы и накопительных культур. Для выделения ДНК из образцов почвы применяли коммерческий набор реактивов Power Soil DNA isolation kit ("МоВю", США) в соответствии с рекомендациями производителя с незначительными модификациями. Концентрацию ДНК и степень чистоты препаратов оценивали по соотношениям OD260/OD280, OD260/OD230 методом спектрофотометрии (Smart Spec Plus, "Bio Rad", США).
Из накопительных культур ДНК выделяли с помощью коммерческого набора реактивов Wizard Genomic DNA Purification Kit, ("Promega", США) в соответствии с протоколом производителя с минимальными модификациями.
Для увеличения выхода микробной ДНК обработку образцов почв и биомассы накопительных культур лизирующим буфером проводили при температуре 80°С и встряхивании.
Амплификация фрагментов генов 16S рРНК и nifH. В табл. 2 приведены последовательности праймеров, использованных в данной работе. Фрагмент гена 16S рРНК амплифицировали с помощью универсальных праймеров 341F и 907R. В случае дальнейшего разделения ампликонов ме-
Таблица 2. Последовательности и специфичность праймерных систем, использованных в настоящем исследовании
Праймер Целевой ген Последовательность (от 5' к 3') Специфичность Литературный источник
341F 16S рРНК GTTTGATCMTGGCTCAG Все Bacteria Muyzer et al., 1993
341F-GC 16S рРНК GTTTGATCMTGGCTCAG (GCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTC CCGCCGCCCCCCGCCCG) Все Bacteria Muyzer et al., 1993
907R 16S рРНК TACGGYTACCTTGTTACGACTT Все Bacteria Muyzer et al., 1993
F1 nifH TAYGGIAARGGIGGIATIGGIAARTC Азотфиксирующие Bacteria и Archea Марусина и др., 2001
R6 nifH GCCATCATYTCICCIG Азотфиксирующие Bacteria и Archea Марусина и др., 2001
nifHfor nifH TAYGGNAARGGNGGHATYGGYATC Азотфиксирующие Bacteria Sarita et al., 2008
nifHrev nifH ATRTTRTTNGCNGCRTAVABBGCCATCAT Азотфиксирующие Bacteria Sarita et al., 2008
nifH-f nifH GGHAARGGHGGHATHGGNAARTC Азотфиксирующие Bacteria Mehta et al., 2003
nifH-r nifH GGCATNGCRAANCCVCCRCANAC Азотфиксирующие Bacteria Mehta et al., 2003
PolF nifH TGCGAYCCSAARGCBGACTC Азотфиксирующие Bacteria Poly et al., 2001
PolR nifH ATSGCCATCATYTCRCCGGA Азотфиксирующие Bacteria Poly et al., 2001
nifH-F nifH AAA GGY GGW ATC GGY AAR TCC ACC AC Азотфиксирующие Bacteria Rósch et al., 2002
nifH-R nifH TTG TTS GCS GCR TAC ATS GCC ATC AT Азотфиксирующие Bacteria Rósch et al., 2002
тодом ДГГЭ использовали прямой праймер с ГЦ-клампом на З'-конце [20]. Амплификацию проводили в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: буфер ДНК-полимеразы (2 мМ М§С12; 17 мМ ^Н4)2804; 67мМ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.