ОНТОГЕНЕЗ, 2004, том 35, № 4, с. 297-306
ГЕНЕТИКА РАЗВИТИЯ
УДК 575.224.23
ОЦЕНКА РОЛИ ОДНОРОДИТЕЛЬСКОЙ ДИСОМИИ В РАННЕЙ
V ____1
ЭМБРИОНАЛЬНОЙ ЛЕТАЛЬНОСТИ ЧЕЛОВЕКА1
© 2004 г. Т. В. Никитина, Е. А. Саженова, Н. Н. Суханова, И. Н. Лебедев, С. А. Назаренко
ГУ Научно-исследовательский институт медицинской генетики Томского научного центра СО РАМН 634050 Томск, наб. р. Ушайки, д. 10 Поступила в редакцию 25.08.03 г.
Окончательный вариант получен 03.02.04 г.
Проведено систематическое исследование вклада однородительской дисомии по 8 хромосомам человека - 2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21-й - в этиологию спонтанной гибели эмбрионов человека. Большинство из этих хромосом имеют синтенные с хромосомами мыши участки с ортологичными им-принтированными генами, нарушение экспрессии которых у мышей связано с эмбриональной летальностью. Скрининг однородительской дисомии у спонтанных абортусов 5-16 нед. беременности проводили путем оценки характера наследования от родителей аллелей полиморфных микросател-литных локусов, расположенных в исследуемых хромосомах. Обследовано 100 эмбрионов человека с цитогенетически определенным нормальным кариотипом, остановка развития которых на ранних этапах внутриутробного развития была объективно установлена с помощью ультразвукового исследования беременных женщин. В ходе исследования 13 эмбрионов были исключены из дальнейшего анализа из-за выявленных при молекулярно-генетическом исследовании аномалий кариотипа или "ложного" отцовства. Случаев однородительской дисомии среди 87 исследованных абортусов не было выявлено ни по одной из изученных хромосом. Суммарный анализ результатов настоящего исследования и четырех других опубликованных работ по поиску однородительской дисомии у погибших эмбрионов и плодов не выявил достоверного повышения ее частоты у спонтанных абортусов по сравнению с теоретически ожидаемым значением, основанным на оценке вероятности сочетания мейотических ошибок в гаметах человека. Полученные данные свидетельствуют о том, что, во-первых, однородительские дисомии по хромосомам человека, имеющим синтенные с хромосомами мыши участки с ортологичными импринтированными генами, не вносят заметного вклада в гибель эмбрионов человека на ранних этапах развития, а во-вторых, механизмы, детерминирующие эмбриолетальность в результате нарушения экспрессии импринтированных локусов, существенно различаются у млекопитающих, далеко отстоящих друг от друга на эволюционной лестнице.
Ключевые слова: однородительская дисомия, геномный импринтинг, ранняя эмбриональная гибель.
Попытки объяснения необычайно высокого уровня ранней эмбриональной смертности, присущей виду Homo sapiens, предпринимаются с разной степенью успеха уже на протяжении более полувека. Тем не менее в среднем лишь для 5060% погибших после имплантации эмбрионов такая причина обнаруживается в виде хромосомного дисбаланса (Hassold et al., 1980; Eiben et al., 1990). Остальные абортусы, имеющие нормальный кариотип, представляют "белое пятно" в понимании причин остановки эмбриогенеза. Не исключено, что в основе нарушения развития таких эмбрионов могут лежать аномалии эпигенетической регуляции активности генов, не связанные с нарушением их структуры. Одним из подобных
1 Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (проект < 96-04-48919).
механизмов является геномный импринтинг (imprint (англ.) - отпечаток), в результате которого специфический характер дифференциальной активности генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. Материальной основой этого феномена является наличие в отдельных участках генома неких молекулярных отпечатков, в частности, аллельспецифического метилирования ДНК, маркирующего их родительское происхождение, которые обеспечивают моноаллельную экспрессию импринтированных генов. В результате для нормального развития эмбриона очень важным является соблюдение баланса хромосом материнского и отцовского происхождения. Одной из возможных причин нарушения такого баланса может быть однородительская дисомия (ОРД), т.е. ошибочное наследование обеих гомологичных хромосом от одного
из родителей. Если данная хромосома содержит импринтированные гены, то в результате ОРД происходит нарушение их нормальной функции, связанное либо с двукратным возрастанием генной активности, либо, напротив, с ее полным отсутствием.
Эффекты импринтинга, проявляющиеся при ОРД, хорошо изучены на таком модельном объекте, как мышь, и около половины из них связаны с гибелью зародыша в ходе эмбриогенеза (Catta-nach, Jones, 1994). У человека ряд ОРД по хромосомам, несущим импринтированные гены, проявляется хорошо очерченными синдромами (например, для хромосом 7, 11, 14 и 15), тогда как ОРД по хромосомам, не содержащим импринтированные локусы, являются фенотипически нейтральными. В то же время из 47 возможных типов од-нородительского наследования целых хромосом у человека (44 типа по 22 аутосомам от каждого родителя и 3 типа - по половым хромосомам) некоторые из вариантов ОРД до сих пор не описаны (Kotzot, 2002). Не исключено, что ОРД по некоторым хромосомам человека может быть причиной ранней гибели эмбрионов и, вследствие этого, они не обнаруживаются у живорожденных индивидов.
Известно всего лишь четыре работы по анализу ОРД у погибших эмбрионов человека, которые выполнены либо на ограниченном количестве материала (Henderson et al., 1994; Shaffer et al., 1998), либо на тотальной выборке спонтанных абортусов с недиагностированным характером нарушения развития (Smith et al., 1998; Fritz et al., 2001). В настоящей работе проверка гипотезы о возможном вкладе ОРД в эмбриолетальность у человека проведена на достаточно обширной выборке случаев ранней эмбриональной гибели (анэмбрионии и неразвивающиеся беременности) с нормальным кариотипом, объективно верифицированных с помощью ультразвукового исследования беременных женщин. Учитывая эволюционную консервативность геномов млекопитающих, особый интерес в настоящем исследовании в первую очередь представляли те хромосомы человека, которые несут гены, ортологичные им-принтированным генам мыши, и ОРД по которым не обнаруживается среди живорожденных индивидов.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Материалом исследования служила ДНК 100 спонтанных абортусов с нормальным кариотипом и ДНК их родителей. Подавляющее большинство абортусов представляли собой определенные при ультразвуковом обследовании беременных женщин случаи ранней эмбриональной гибели. Из них 64 случая составили неразвивающиеся беременности, 25 - анэмбрионии и 11 - соб-
ственно спонтанные аборты. Эмбриональный материал, представленный, как правило, тканями зародышевого мешка, поступал из гинекологических клиник г. Томска. Гестационный возраст варьировал от 5 до 16 нед. и в среднем составлял 8.5 ± 2.6 нед. Возраст родителей находился в пределах от 17 лет до 41 года - для матерей и от 19 до 39 лет - для отцов и в среднем составил 25.3 ± 4.9 и 27.7 ± 5.2 лет соответственно. Соотношение полов в обследуемой выборке абортусов составило 0.61 (62 эмбриона с кариотипом 46, XX и 38 - с кариотипом 46, XY). Кариотип абортусов устанавливали путем анализа G-окрашенных препаратов метафазных хромосом, полученных в результате длительного культивирования экстраэмбриональных фибробластов в соответствии с описанными ранее методами (Суханова и др., 2002).
Поиск ОРД по восьми хромосомам человека -2, 9, 11, 15, 16, 19, 20 и 21 - проводили с помощью анализа характера наследования абортусом от родителей аллелей полиморфных ДНК-маркеров, локализованных в указанных хромосомах. ДНК из лимфоцитов периферической крови родителей и из замороженных экстраэмбриональных тканей спонтанных абортусов выделяли стандартными методами (Евдокимова и др., 2000). Для анализа наследования хромосом использовали комплекс из 26 тетрануклеотидных маркеров - D2S1242, D2S1788, D9S768, D9S252, D11S1304, D11S1983, D15S11, D15S172, D15S113, D15S659, GABRB3, D15S817, D15S642, D15S643, D16S685, D16S2624, D16S752, D19S601, D19S559, D19S394, D20S161, D20S168, D20S431, D21S11, D21S1435 и D21S1413. Информация о последовательностях олигонуклеотидных праймеров и условиях амплификации была получена из геномной базы данных (www.gdb.org). Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили на программируемых термоциклерах "Терцик" ("ДНК-технология", Россия) и "MiniCycler" ("MJ Research", США). Продукты ПЦР разделяли электрофорезом в нативном 7 и 8%-ном полиакриламидном геле. Визуализацию фрагментов ДНК проводили в ультрафиолетовом свете после окрашивания бромистым этидием. Результаты анализа регистрировали с применением системы компьютерной видеосъемки "UV-VIS Imager II" ("AAB", США).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате исследования 100 семей с невынашиванием беременности, обследованных с помощью панели микросателлитных ДНК-маркеров, из дальнейшего анализа исключено четыре случая, для которых выявлено "ложное" отцовство, и 9 эмбрионов, продемонстрировавших отклонения от эуплоидности, причиной которых послужила контаминация культур экстраэмбриональных фибробластов клетками матери или
хромосомный мозаицизм в клетках плодного мешка. Таким образом, анализ ОРД проводили на выборке из 87 абортусов без хромосомных нарушений (51 эмбрион с кариотипом 46, XX и 36 - с кариотипом 46, XY, соотношение полов = 0.71).
Нормальное биродительское наследование (БРН) целой хромосомы устанавливалось в случае, если эмбрион - гетерозигота по данному ло-кусу - получал от отца и матери разные аллели или путем комбинирования результатов анализа по двум частично информативным маркерам на данную хромосому, когда по одному локусу можно было исключить ОРД материнского (ОРД мат), а по другому - ОРД отцовского (ОРД отц) происхождения. Заключение о наличии ОРД могло быть сделано только по результатам анализа двух и более информативных маркеров, так как отклонение от менделевской сегрегации аллелей в семье может быть вызвано помимо ОРД еще и мутациями в микросателлитных последовательностях, частота которых относительно высока (Brinkmann et al., 1998; Xu et al., 2000). Проведенный анализ выявил исключительно биродительс
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.