ОБЩАЯ РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК [57+61]::539.1.04:576.88:576.32/.36:614.7:614.876:581.6
ОЦЕНКА РОЛИ ПРОЦЕССОВ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК И ГЛУТАТИОН-ЗАВИСИМОГО ПУТИ ДЕТОКСИКАЦИИ В ОТВЕТНОЙ РЕАКЦИИ ХЛОРЕЛЛЫ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ УРАНА
© 2013 г. Т. И. Евсеева1, Т. А. Майстренко1, С. А. Гераськин2
Институт биологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар 2ВНИИ сельскохозяйственной радиологии и агроэкологии РАСХН, Обнинск
Изучено токсическое действие 238U (в виде нитрата уранила) в диапазоне концентраций 0.04— 84 мкмоль/л на популяцию клеток хлореллы (Chlorella vulgaris Beijerink). Зависимость токсического эффекта от концентрации 238U наилучшим образом аппроксимируется моделью Брейна—Косенса (Brain—Cousens), используемой для описания гормезиса. Достоверное увеличение прироста биомассы хлореллы, оцененного как по оптической плотности суспензии, так и по уровню флюоресценции хлорофилла а, выявлено в диапазоне 17—29 мкмоль/л 238U с максимумом при концентрации 23 мкмоль/л. Достоверный токсический эффект радионуклид вызывает при содержании 38 мкмоль/л, а при 53 мкмоль/л — ингибирует прирост биомассы хлореллы на 50%. В присутствии 0.02 ммоль/л кофеина (ингибитора процессов восстановления повреждений ДНК) и DL-бутионин-^,К)-сульфоксимина (ингибитора ключевого фермента синтеза глутатиона — у-глутамилцистеин-синтетазы) усиливается токсический эффект низких концентраций 238U.
Chlorella vulgaris, уран, гормезис, детоксикация, репарация ДНК. DOI: 10.7868/S0869803113020033
Активное изучение распределения и миграции урана в окружающей среде пришлось на начало XX столетия. В этот же период появились первые обобщения результатов оценки эффектов, которые он вызывает при поступлении в организм животных и растений. Итоги проведенных исследований стали основой для нормирования содержания урана в среде обитания человека.
В последнее десятилетие интерес к изучению токсических [1, 2] и генотоксических [3—5] эффектов урана возрастает, что во многом связано с увеличением его содержания в компонентах наземных и водных экосистем в местах добычи и переработки урановых руд, хранения, использования и утилизации радиоактивных отходов.
Особое внимание уделяется оценке токсичности урана для гидробионтов вследствие повышенной биологической доступности растворимых соединений радионуклида, в виде которых он может поступать в поверхностные и грунтовые воды после технологических процессов, связанных с переработкой и обогащением урановых руд [6]. Содержание урана в поверхностных и подземных пресных водах варьирует от 0.02 до 6 мкг/л и может повышаться до 2 мг/л вблизи ураноносных провинций [7, 8]. Оценка токсичности урана для
* Адресат для корреспонденции: 249032 Обнинск, Калужская обл., Киевское шоссе, 109 км, ГНУ ВНИИСХРАЭ РАСХН; e-mail: stgeraskin@gmail.com.
пресноводных организмов в этом важном с точки зрения экологического нормирования диапазоне является предметом современных токсикологических исследований [9—12].
На биоаккумуляцию урана и его токсичность для пресноводных организмов существенно влияет продолжительность воздействия, физические и химические характеристики водной среды, такие как окислительно-восстановительные и ще-лочно-кислотные условия, жесткость, присутствие органических веществ и других комплексо-образователей [9—15].
Наряду с хорошей изученностью закономерностей формирования токсических эффектов при аккумуляции урана гидробионтами мало внимания уделяется познанию механизмов их устойчивости к воздействию радионуклида. Расшифровка этих механизмов остается существенным пробелом в наших знаниях.
Токсичность урана обусловлена во многом его способностью как переходного химического элемента и как излучателя индуцировать образование активных форм кислорода [15] и свободных радикалов [16]. Нарушение окислительно-восстановительных процессов в клетках при воздействии урана приводит к повышению активности ферментов антиоксидантной защиты [17—19].
Но ферменты-антиоксиданты катализируют преимущественно реакции детоксикации су-
пероксида и перекиси водорода. Обезвреживание таких реактивных производных кислорода как синглетный кислород, гидропероксидный радикал и гидроксил-радикал не находится под ферментативным контролем, поскольку константы скорости их взаимодействия с потенциальными реакционными партнерами в типичном окружении очень высоки для ферментативного катализа [20]. Оксидативное повреждение ДНК ведет к образованию модифицированных оснований, сайтов без основания, повреждений дезоксирибозы, одно- и двунитевых разрывов ДНК, сшивок ДНК-белок [21, 22]. Репарация каждого типа повреждения происходит по специфичному механизму [23, 24].
На основании вышесказанного мы предположили, что помимо ферментов антиоксидантной защиты важную роль в обеспечении устойчивости клеток к воздействию урана могут играть глутати-он-зависимый путь детоксикации и процессы репарации повреждений ДНК, а ингибирование этих защитных механизмов будет приводить к усилению токсического эффекта.
Цель наших исследований состояла в оценке роли процессов восстановления повреждений ДНК и глутатион-зависимого пути в ответной реакции популяции клеток хлореллы (Chlorella vulgaris Beijerink) на воздействие 238U.
Для проверки указанной гипотезы и реализации цели исследований были решены следующие задачи:
1) оценена зависимость прироста биомассы хлореллы от содержания 238U в растворе и определены действующие концентрации радионуклида;
2) изучено модифицирующее действие кофеина (ингибитора процессов восстановления повреждений ДНК) и бутионинсульфоксимина (ингибитора ключевого фермента синтеза глутатиона — у-глутамилцистеинсинтетазы) на токсичность 238U для хлореллы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объект исследований и условия культивирования. Одноклеточная зеленая водоросль Chlorella vulgaris Beijerink является стандартным объектом для оценки токсичности модельных растворов неорганических и органических соединений, природных и сточных вод, водных вытяжек из почв [9, 11, 25]. В наших исследованиях использован термофильный штамм Ch. vulgaris Beijerinck (S-39/64688) из коллекции Института биологии Санкт-Петербургского университета.
Культуру водоросли наращивали на 50%-ной среде Тамийя, из которой был исключен ком-плексообразователь ЭДТА, при постоянных температуре (36 ± 0.5°C), освещенности (1400 лк) и содержании CO2 0.03% в атмосферном воздухе.
Изучение влияния 238U на прирост биомассы хлореллы. Перед проведением экспериментов по оценке токсичности 238U приготовленную описанным выше способом суспензию хлореллы фильтровали, разбавляли 50%-ной средой Та-мийя до оптической плотности 0.140 ± 0.005 и тщательно перемешивали. Затем 0.25 мл полученной суспензии автоматическим микродозатором засевали в кюветы с 6 мл дистиллированной воды (контрольный образец 1) либо раствора нитрата уранила определенной концентрации (экспериментальный образец). Экспериментальные образцы готовили путем разбавления раствора нитрата уранила с концентрацией по катиону 5.44 ммоль/л (1.29 г/л). Оценивали токсичность 238U в диапазоне концентраций 0.04—84 мкмоль/л (0.009-20 мг/л).
Оптическая плотность суспензии хлореллы в начале эксперимента составляла 0.006, что соответствовало 154000 ± 26000 клеток/мл каждого контрольного и экспериментального образца. Оценку плотности культуры водоросли проводили с использованием камеры Горяева [26].
По шесть кювет с контрольными и двенадцать с экспериментальными образцами помещали на 24 ч в каждый культиватор для наращивания хлореллы. Температура (36 ± 0.5°C) и освещенность (1400 лк) поддерживались постоянными в течение всего эксперимента.
В первой серии исследований оценивали прирост биомассы водоросли по оптической плотности [27], измеренной на спектрофотометре Spectrumlab SS2107 (LEKI instruments, Финляндия) при длине волны 670 нм.
На втором этапе в независимом исследовании прирост биомассы хлореллы определяли по уровню флюоресценции хлорофилла a в суспензии клеток in vivo [28] на спектрофлюориметре "Флю-орат-02-ПАН0РАМА" ("Люмекс", РФ). Измерения проводили в шести повторностях, используя кварцевую кювету объемом 4 мл, при длине волны возбуждения 410 нм и максимуме флюоресценции 685 нм для хлорофилла а [29].
Выбор модифицирующих токсический эффект 238Uреагентов и их концентраций. Для оценки роли процессов восстановления повреждений ДНК и глутатион-зависимого пути в ответной реакции хлореллы на воздействие 238U использовали соответственно DL-бутионин-(S,R)-сульфоксимин (BSO) и кофеин. BSO является селективным ингибитором у-глутамилцистеинсинтетазы (y-ECS), ключевого фермента синтеза глутатиона [30]. BSO используют для определения снижения уровня глутатиона в клетках при воздействии стрессоров и оценки роли биосинтеза фитохела-тинов в детоксикации тяжелых металлов [30-32].
Кофеин, являясь алкалоидом пуринового ряда, повышает чувствительность клеток к летальным и мутагенным эффектам ДНК-повреждаю-щих агентов вследствие нарушения метаболизма ДНК за счет ингибирования ферментов синтеза и репарации ДНК [33—36]. Кофеин нарушает процессы регуляции клеточного цикла, что может приводить либо к появлению условий для репарации повреждений, либо к апоптозу [37, 38].
В предварительных экспериментах мы установили, что BSO в диапазоне концентраций 0.02— 0.3 ммоль/л не приводит к достоверному снижению прироста биомассы хлореллы за 24 ч [27]. В то же время 0.02 ммоль/л BSO ингибирует синтез глутатиона in vitro [30]. Поэтому данная концентрация была выбрана для изучения роли глутати-онзависимого пути в снижении токсичности 238U для клеток хлореллы.
Кофеин не оказывал значимого влияния на прирост биомассы хлореллы за 24 ч при содержании в суспензии от 0.02 до 1.3 ммоль/л [27]. Концентрация кофеина 0.02 ммоль/л, эквимолярная содержанию BSO, была выбрана для изучения роли нарушений метаболизма ДНК в ответной реакции хлореллы на воздействие 238U.
Эксперименты по совместному влиянию 238U с BSO либо кофеином на прирост биомассы хлореллы проводили в тех же условиях, что и в случае изучения раздельного действия радионуклида. В каждой кювете содержалось 0.25 мл суспензии водоросли (с оптиче
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.