ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ПАТОЛОГИЯ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ
УДК 616.8-092
ОЦЕНКА СЕНСОМОТОРНОГО ДЕФИЦИТА В ОТДАЛЕННОМ ПЕРИОДЕ ПОСЛЕ ИШЕМИИ/ГИПОКСИИ ГОЛОВНОГО МОЗГА НЕОНАТАЛЬНЫХ КРЫС
© 2013 г. Д. Н. Силачёв1, М. И. Шубина1, С. С. Янкаускас12, В. П. Мкртчян1, В. Н. Манских2, М. В. Гуляев3, Д. Б. Зоров1
1Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского
государственного университета им. М.В. Ломоносова, Факультет биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова,
3Факультет фундаментальной медицины Московского государственного университета
им. М.В. Ломоносова, e-mail: zorov@mail.genebee.msu.ru Поступила в редакцию 25.06.2012 г. Принята в печать 19.10.2012 г.
Методом магнитно-резонансной томографии показано, что ишемия/гипоксия головного мозга новорожденных крысят, выполненная по методу Левина—Райса, вызывает односторонние повреждения в области коры больших полушарий, стриатуме и гиппокампе. Одностороннее ишемическое повреждение приводит к долгосрочным сенсомоторным и поведенческим нарушениям через 90—115 сут после операции при тестировании животных в наборе, состоящем из тестов "Цилиндр", "Сужающаяся дорожка", Монтойа и "Постановка конечности на опору". Подобранная нами комбинация тестов в сочетании с магнитно-резонансной томографией позволяет достоверно оценить отдаленные сенсомоторные нарушения у взрослых животных, перенесших травму в неонатальном периоде.
Ключевые слова: ишемия/гипоксия, новорожденные, неврологический дефицит, сенсомоторный дефицит.
Evaluation of a Long-Term Sensomotor Deficit after Neonatal Rat Brain
Ischemia/Hypoxia
D. N. Silachev, M. I. Schubina, S. S. Jankauskas, V. P. Mkrthyan, V. N. Manskikh, M. V. Gulyaev, D. B. Zorov
Belozersky Institute of Physico-Chemical Biology, Lomonosov Moscow State University, Department of Bioengineering and Bioinformatics, Lomonosov Moscow State University, Department of Fundamental Medicine, Lomonosov Moscow State University, Russia, e-mail: zorov@mail.genebee.msu.ru
The application of magnetic resonance imaging method showed that ischemia/hypoxia of the brain of neonatal rats made by the protocol suggested by Levine—Rice induces one-sided lesions in the areas of cerebral cortex, striatum and hippocampus. Unilateral ischemic injury leads to a long-term sensorimotor and behavioral distortions within 90—115 days after the operation which has been tested in animals by the battery of tests including Cylinder, Beam-walking, Staircase and Limb-placing test. Chosen battery of tests in combination with magnetic resonance imaging allows to reliably estimate the long-term sensorimotor recovery in adult animals suffered an injury in neonatal age.
Keywords: ischemia/hypoxia, neonatal, neurologic impairment, sensorimotor disability. DOI: 10.7868/S0044467713030131
Неонатальная ишемия и/или гипоксия (ИГ) у человека являются основными факторами риска возникновения неврологических нарушений, которые часто проявляются в виде сенсомоторного и опорно-двигательного дефицита, церебрального паралича в детском возрасте и в зрелости [9].
Для экспериментального моделирования данного патологического состояния новорожденных с целью поиска нейропротек-торных препаратов широко используется модель С.Левина [17], модифицированная Дж.Е. Райсом [22], основанная на унилате-ральной перерезке сонной артерии с последующей системной гипоксией. В этой модели достаточно точно воспроизводятся патомор-фологические и функциональные нарушения, наблюдаемые у новорожденных после ишемии/гипоксии головного мозга [3].
Было установлено, что оценка моторного и сенсомоторного дефицита является достаточно объективным показателем функциональных нарушений мозга в модели Левина— Райса [15]. Однако до настоящего времени в большей части работ по оценке неврологического дефицита в модели ИГ все измерения были выполнены только в краткосрочный период [5, 6, 15, 18, 32]. В этих исследованиях показана существенная задержка развития некоторых моторных и когнитивных функций преимущественно в первые 3 недели после неонатального ишемического/гипокси-ческого повреждения. Имеются только единичные работы, где изучались когнитивные и локомоторные расстройства в течение продолжительного периода времени (более 3 мес.) [15, 32]. Таким образом, большинство используемых различными исследователями сенсомо-торных тестов способно выявить неврологический дефицит только в течение первых недель после ишемии [7], что обусловлено высокой компенсаторной реорганизацией мозга новорожденных [20, 21, 29]. В то же время вторичная дегенерация нейронов в позднем постишемическом периоде может отменять ранний положительный эффект терапевтического воздействия или само лечение может приводить к поздней гибели клеток [24].
Таким образом, существует очевидная необходимость в применении чувствительных долгосрочных протоколов измерения нейро-функциональных показателей у экспериментальных животных в модели ИГ мозга новорожденных. Ряд исследователей приходят к
выводу, что протокол оценки функциональных последствий повреждения головного мозга должен быть мультимодальным, состоящим из нескольких поведенческих тестов, направленных на всестороннюю оценку сен-сомоторных и когнитивных функций в долгосрочном периоде [12, 27, 28]. Разработка подробных схем оценки неврологического дефицита в течение продолжительного времени является необходимым условием для всестороннего изучения потенциальных ней-ропротекторных стратегий.
В настоящем исследовании были отобраны тесты, которые наиболее эффективно показали себя в оценке долгосрочного сенсомо-торного дефицита у взрослых животных после фокальной ишемии [10, 24]. Были выбраны тест "Цилиндр" для оценки асимметрии использования передних конечностей, тест "Сужающаяся дорожка", выявляющий опорно-двигательный дефицит, и тест Монтойа, являющийся высоко-чувствительным для оценки тонкой моторики передних конечностей. Также нами была использована балльная оценка неврологического дефицита — тест "Постановка конечности на опору". Кроме того, в настоящей работе применен метод магнитно-резонансной томографии (МРТ) для ранней неинвазивной оценки зоны повреждения незрелого головного мозга с последующим сравнением сформировавшегося очага во взрослом мозге и сопоставлением полученных данных с нейрофункциональ-ными изменениями.
Целью настоящей работы была разработка протокола оценки сенсомоторного и опорно-двигательного дефицита в отдаленном периоде после неонатальной ИГ на основании описанных выше тестов, направленных на комплексную и устойчивую оценку функциональных изменений.
МЕТОДИКА Животные
В работе использовались нелинейные крысы, содержавшиеся в условиях вивария с 12-часовым световым циклом при постоянной температуре (22 ± 2°С). При работе с животными соблюдались требования, сформулированные в Директивах Совета Европейского сообщества 2010/63/EU об использовании животных для экспериментальных исследований. Количество крысят в помете составля-
ло 9—12. Для эксперимента было отобрано 39 7-дневных крысят обоих полов массой от 9 до 14 г.
Моделирование ишемического/гипоксического повреждения
Крысят из одного помета случайным образом делили на три группы: контроль (п = 12) — интактные животные, ИГ (п = 15) — крысы с ишемией/гипоксией мозга и гипоксией мозга (гипокс, п = 12). В группе ИГ была проведена операция по методу Левина—Райса с некоторыми модификациями для получения ишемического/гипоксического повреждения головного мозга [22]. Животных анестезировали 1%-ным изофлюраном. Выделяли левую общую сонную артерию и пережигали ее электрокаутером, далее крысят подвергали в течение 2 ч системной гипоксии в смеси газов, содержащей 8% кислорода и 92% азота. После гипоксии животных возвращали к матери. С животными группы Гипокс проводили те же манипуляции, как в группе ИГ, за исключением пережигания общей сонной артерии. Для поддержания постоянной температуры тела во время операции и до выхода из наркоза крысят помещали на термостатируемый коврик (35 ± 1°С). Длительность операции составляла около 10 мин.
Поведенческие тесты
Все поведенческие тесты были выполнены на оборудовании ООО "НПК Открытая Наука". В тестах оценивался функциональный дефицит в передних и задних конечностях, контралатеральных левому поврежденному полушарию.
Тест "Постановка конечности на опору"
Используемый протокол основан на методике, описанной Де Риком и соавт. [8] и модифицированной Ю. Ёолкконеном и соавт. [16]. Крысы были приучены к рукам за 3 дня до тестирования. Тест "Постановка конечности на опору" использовался для оценки неврологического дефицита у животных в возрасте 42 и 90 сут. Тест состоял из семи испытаний, оценивающих сенсомоторную интеграцию передних и задних конечностей в ответ на тактильную, проприоцептивную и зрительную стимуляцию.
1. Крысу передними конечностями размещали на край стола, придерживая туловище. Каждую переднюю лапу поочередно аккуратно сталкивали с края стола, контролируя ее возвращение и размещение. В норме крыса сразу же возвращала конечность на место.
2. Выполнялось так же, как первое испытание, но с некоторым изменением: голову крысы отводили вверх под углом 45 град., таким образом не давая ей возможность видеть поверхность стола или контактировать с ней вибриссами.
3. Крысу размещали параллельно краю стола и переднюю лапу отводили в сторону.
4. Так же как в 3-м испытании, но только для задней конечности.
5. Крысу задними лапами ставили на край стола и каждую лапу поочередно отводили вниз.
6. Крысу размещали передними лапами у края стола и аккуратно подталкивали за туловище по направлению к краю стола. В норме крыса сопротивлялась толканию, перебирая и упираясь передними лапами, но у крыс с ишемией мозга поврежденная конечность соскальзывала.
7. Крысу держали за корень хвоста и медленно опускали на поверхность стола. В норме крыса вытягивала вперед передние конечности за 10 см до поверхности стола.
Тест оценивался следующим образом: крыса выполняла испытание нормально — 2 балла; крыса выполняла испытание с промедлен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.