МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 73, № 2, с. 241-247
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ :
УДК 631.46:579.8.018.8
ОЦЕНКА СУММАРНОЙ И АКТИВНОЙ МИКРОБНОЙ БИОМАССЫ РАЗНОВОЗРАСТНЫХ ПОДКУРГАННЫХ ПАЛЕОПОЧВ
© 2004 г. Т. Э. Хомутова, Т. С. Демкина, В. А. Демкин
Институт физико-химических и биологических проблем почвоведения РАН, Пущино
Поступила в редакцию 21.10.2002 г.
Из степных палеопочв, погребенных под разновозрастными курганами от 5800 до 750 лет назад, выделены микробные фракции, оценена полнота выделения микробных клеток и рассчитана суммарная биомасса, включающая легко реактивируемые для активного метаболизма клетки и покоящиеся формы (в том числе не способные к образованию колоний). Определена биомасса активно ме-таболизирующих клеток. По соотношению активной и суммарной микробной биомассы проведена оценка состояния микробных сообществ современных фоновых и погребенных почв. Показано, что в палеопочвах суммарная, активная биомассы микроорганизмов, а также доля активной биомассы в микробном сообществе значительно ниже, чем в современных почвах. Закономерное снижение доли активных микроорганизмов в микробных сообществах в хроноряду палеопочв, однако не является монотонным. Наблюдается как сравнительно высокая величина суммарной биомассы микроорганизмов при минимальной их активности (палеопочва, погребенная 4000 лет назад), так и сравнительно низкая суммарная биомасса при относительно высокой активности микроорганизмов (палеопочвы, погребенные 1950 лет назад). Предполагается, что эти факты связаны с динамикой палеоклиматических условий.
Ключевые слова: микробная фракция, суммарная и активная биомасса, палеопочвы.
Микроорганизмы являются динамичной и специфической частью почв. Они преодолевают стрессовые условия окружающей среды (неблагоприятный гидротермический режим, недостаток питания и др.) и сохраняются в ней неопределенно долго посредством перехода в покоящееся состояние [1]. При этом наряду со спорами существенную часть микробного сообщества составляют клетки в "спороподобной" покоящейся стадии. Такие клетки имеют размеры менее 0.3 мкм, характеризуются низким уровнем метаболизма (дыхания) и не способны к росту и образованию колоний при выращивании в лабораторных условиях [2]. При изучении микробных сообществ современных и погребенных почв засушливых природных регионов (сухие степи, полупустыни) логично предположить, что значительная часть сообществ находится в состоянии покоя. В связи с этим актуальной проблемой становится определение суммарной биомассы микроорганизмов, включающей максимальное число клеток на разных стадиях их жизненного цикла. Используемые в настоящее время методы позволяют оценить лишь часть микробного сообщества, которая поддается культивированию на разнообразных средах, прямому подсчету с использованием специфических красителей или оценке по физиологической активности [3, 4].
В 70-е годы прошлого столетия была предложена методика разделения грибов и бактерий на
основе механического разрушения почвенных агрегатов, экстракции солевым раствором и центрифугирования [5]. Этот метод позволяет перевести в почвенный экстракт из торфянистой почвы 50-80% бактерий, тогда как грибы и остальная часть бактерий остается в почвенном осадке. С помощью этого метода удалось экстрагировать до 88% микроорганизмов из песчаных и около 30% микроорганизмов - из суглинистых почв [6].
В подкурганных палеопочвах, которые находятся в состоянии длительного погребения (сотни и тысячи лет), значительная доля микробного сообщества пребывает в покоящемся состоянии. Поэтому при исследовании таких объектов особую актуальность приобретают вопросы определения суммарной микробной биомассы, включающей как легко реактивируемые глюкозой (обозначим их как "метаболически активные"), так и глубоко покоящиеся бактериальные клетки, включая споры микроорганизмов. Выделение из почв микробной фракции с оценкой полноты выделения позволит рассчитать суммарную биомассу микробного сообщества, а сопоставление последней с биомассой метаболически активных микроорганизмов может быть полезной сравнительной характеристикой состояния микробного сообщества в палеопочвах различного возраста и современных фоновых почвах.
Целью настоящей работы было выделение микробной фракции и определение суммарной
микробной биомассы активно метаболизирую-щих и покоящихся клеток (включая не способные образовывать колонии на стандартных средах), а также оценка доли активно метаболизирующих клеток в микробных сообществах подкурганных палеопочв различного возраста и современных фоновых почв.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Описание исследованных почв
Исследования проводили на трех ключевых участках (курганных могильниках), расположенных в различных природных районах сухостеп-ной зоны на территории Приволжской и Ерге-нинской возвышенностей (Волгоградская обл.). Объектами изучения послужили палеопочвы десяти курганов, время сооружения которых относится к эпохам энеолита, бронзы, раннего железа и средневековья в хроноинтервале с IV тыс. до н.э. до XIII в. н.э. (5800-750 лет назад). Археологические памятники приурочены к современным ареалам каштановых почв и солонцов. Приведем краткую характеристику изученных объектов.
Приволжская возвышенность. Курганный могильник "Авиловский" расположен на первой и второй надпойменных террасах р. Иловли (левый приток Дона). Исследованный хроноряд представлен каштановидной (К) почвой (разрез Д-510), погребенной 4000 лет назад, а также разновозрастными каштановыми (К2) почвами, погребенными 1950 (разрез Д-503), 1800 (разрез Д-509) и 750 (разрез Д-504) лет назад. Разрез Д-505 современной фоновой каштановой почвы находится на целинном участке с типчаково-белополынной растительной ассоциацией.
Курганный могильник "Малая Воробцовка" находится на первой надпойменной террасе р. Бердия (левый приток Иловли) на старозалежном участке со злаково-белополынной растительной ассоциацией. Изучены погребенная (1950 лет назад) и современная фоновая каштановые почвы (разрезы Д-526 и Д-525 соответственно).
Ергенинская возвышенность. Курганный могильник "Перегрузное" приурочен к межбалочному водоразделу с целинным растительным покровом (полынно-типчаковая ассоциация). Исследовано два хроноряда подкурганных и современных почв. Один из них включает темно-каштановую (К3) почву, погребенную 5800 лет назад (разрез Д-523), каштановидную почву, погребенную 3900 лет назад (разрез Д-520), каштановые почвы, погребенные 1950 и 1800 лет назад (разрезы Д-518 и Д-512 соответственно), и современную фоновую каштановую почву (разрез Д-519). Второй хроноряд представлен погребенным 1950 лет назад и современным фоновым солонцами (Сн), разрезы Д-516 и Д-514 соответственно.
Нами проводился анализ образцов из горизонта А1 разновозрастных подкурганных и современных фоновых почв. Образцы отбирали с соблюдением условий стерильности в августе 2000 г. До начала анализов образцы хранили при температуре и влажности, соответствующим таковым в момент отбора.
Выделение микробной фракции
Методика выделения микробной фракции из почвы включала следующие этапы: физическое разрушение почвенных агрегатов обработкой ультразвуком как рекомендовано Рамзай [7], экстракцию микробной фракций солевым раствором Виноградского (разведенным 1 : 20) и отделение ее от почвенного остатка центрифугированием согласно методике Фэгри с соавт. [5]. Полученную микробную фракцию осаждали высокоскоростным центрифугированием, лиофилизировали, определяли ее массу и содержание в ней органического углерода. Почвенную навеску 5 г (масса на-тивного образца) размешивали в 300 мл солевого раствора Виноградского (разведенного 1 : 20), обрабатывали ультразвуком двумя импульсами по 30 с с паузой между ними 30 с при 44 Гц и 0.5 мА на установке УЗДН-2 с титановым наконечником диаметром 15 мм. Состав солевого раствора Виноградского следующий (г/л): (КН4)2804 2.0; К2НР04 1.0; М§Б04 0.5; Бе804 0.4; 2.0. Экстракт, содержащий микробные клетки, отделяли от почвенного осадка центрифугированием при 2000 g в течение 30 мин при охлаждении (4°С) и помещали в холод. К почвенному осадку добавляли следующие 250 мл солевого раствора, повторяли процедуры описанные выше. Экстракцию проводили троекратно. Объединенные экстракты от трех обработок, содержащие микробную фракцию, коэкстрагированные мельчайшие минеральные частицы и, возможно, некоторое количество гумино-вых водорастворимых веществ, центрифугировали при 2000 g в течение 30 мин при охлаждении для осаждения минеральных частиц. Супернатант переносили в новые центрифужные стаканы, а клетки, десорбированные с почвы в солевой раствор, осаждали центрифугированием при 7000 g в течение 90 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, осажденную фракцию промывали от возможного загрязнения гуминовыми веществами суспен-дированием в 0.1% растворе пирофосфата натрия и переносили количественно в малые (диаметр 13 мм, высота 75 мм) центрифужные стаканы с известным весом. Осаждали микробную фракцию высокоскоростным центрифугированием при 10000 g в течение 30 мин. Надосадочную жидкость отбрасывали, осажденные клетки лиофилизировали и определяли их массу. Все растворы перед употреблением были стерилизованы и охлаждены до 4°С, экстракты в процессе выделения хранили при 4°С.
Определение содержания органического углерода в выделенной фракции
Содержание органического углерода (Сорг) в выделенных и лиофилизированных микробных фракциях определяли методом бихроматного окисления спектрофотометрически [8]. Образцы каждой почвы анализировали в трех повторностях. Относительная ошибка определения содержания органического углерода в выделенных фракциях не превышала 11%.
Оценка полноты выделения микробной фракции из почвы
Полноту выделения микроорганизмов из почвы оценивали по "метке", в качестве которой использовали численность микроорганизмов, образующих колонии. Численность колониеобразую-щих единиц (КОЕ) определяли в исходной почве и выделенной микробной фракции посевами на чашках с агаризованной средой (почвенный агар) общепринятым методом. Подсчет КОЕ проводили после 7 сут инкубации при 25°С. По величине КОЕ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.