МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК [57+61::539.1.04:575.174.015.3:577.3'1:614.876
ОЦЕНКА СВЯЗИ ПОЛИМОРФИЗМОВ ГЕНОВ С ЧАСТОТОЙ И СПЕКТРОМ ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИХ АНОМАЛИЙ У ЗДОРОВЫХ РАБОТНИКОВ СИБИРСКОГО ХИМИЧЕСКОГО КОМБИНАТА, ПОДВЕРГАВШИХСЯ РАДИАЦИОННОМУ ВОЗДЕЙСТВИЮ (MICROARRAY ИССЛЕДОВАНИЯ)
© 2013 г. Н. В. Литвяков1,2, О. О. Гончарик1, М. Б. Фрейдин3, А. Э. Сазонов1, Е. О. Васильева1, С. А. Межерицкий1, М. В. Халюзова1, А. А. Бондарюк1, Е. Н. Альбах1, А. Б. Карпов1*, Р. М. Тахауов1
1 Северский биофизический научный центр ФМБА России, Северск 2 Научно-исследовательский институт онкологии СО РАМН, Томск 3 Научно-исследовательский институт медицинской генетики СО РАМН, Томск
Представлены результаты исследования по оценке связи полиморфных вариантов генов-кандидатов индивидуальной радиочувствительности человека с частотой и типом цитогенетических нарушений у здоровых работников Сибирского химического комбината, подвергавшихся профессиональному радиационному воздействию в дозе 100—300 мЗв. Генотипирование образцов ДНК 96 работников проводили на олигонуклеотидном микрочипе "Cancer_SNP_Panel GT-17-211" ("Illumina"), содержащем 1 421 SNP-маркера 406 генов. У всех обследованных был проведен стандартный цитогенетический анализ. Проведен анализ ассоциаций SNP с цитогенетическими показателями — частототами аберрантных клеток и следующих аберраций хромосом: хроматидных фрагментов, хроматидных обменов, парных фрагментов, точечных фрагментов, дицентрических хромосом, кольцевых хромосом, транслокаций. Установлено 40 SNP (rs1800389, rs1051690, rs2392221, rs1041163, rs2114443, rs6083, rs1760904, rs4986894, rs488133, rs7462102, rs11249938, rs34206126, rs33945943, rs34324628, rs5742694, rs978458, rs5742667, rs2373721, rs2162679, rs889162, rs2233679, rs2010457, rs2873950, rs1574154, rs10934500, rs4688046, rs10934503, rs4624596, rs2288729, rs4227, rs1367696, rs751087, rs1269486, rs1149901, rs1800404, rs887477, rs696405, rs751087, rs8192284, rs312016), ассоциированных с частотой различных типов хромосомных аберраций (p-value с поправкой FDR Бенджамини—Хокберга < 0.05), из них 24 SNP (подчеркнуты) сопряжены более чем с одним типом хромосомных аберраций. В дальнейшем предполагается исследовать связь этих SNP с вышеперечисленными цитогенетическими показателями на выборке более 600 человек.
Полиморфизм генов, хромосомные аберрации, индивидуальная радиочувствительность, низкие дозы облучения.
DOI: 10.7868/S0869803113020069
Анализ генетических эффектов действия ионизирующего излучения (ИИ) считают одним из наиболее перспективных направлений исследования индивидуальной радиочувствительности человека (ИРЧ). Основными показателями оценки ИРЧ считают уровни индуцированных хромосомных аберраций (ХА) у пациентов или выход радиа-ционно-обусловленных заболеваний, прежде всего, злокачественных новообразований (ЗНО) [1, 2]. В ряде исследований показано, что высокая частота ХА в лимфоцитах периферической крови, и, главным образом, аберраций хромосомного типа,
* Адресат для корреспонденции: 636013, Томская обл., ЗАТО Северск, г. Северск-13, а/я № 130 СБН Центр ФМБА России; тел./факс: (3823) 99-40-01, 99-40-02; e-mail: nvlitv72@yandex.ru; mail@sbrc.ru; conf@sbrc.ru.
возникающих под действием ИИ, ассоциирована с повышенным риском развития ЗНО [3—8]. Нами показана возможность рассмотрения повышенного уровня аберраций хромосомного типа как прогностического маркера риска развития ЗНО [9]. В этой связи поиск способов предиктивной оценки вероятности индукции цитогенетических аномалий при возможном контакте с источниками ИИ (например, во время работы на предприятиях атомной отрасли) является актуальной задачей.
Рядом авторов в больших обзорах [10—13] поставлен вопрос о связи генетических полиморфизмов и цитогенетических нарушений при различных генотоксических воздействиях в контексте оценки возможности прогнозирования чувствительности к этим мутагенным факторам.
В исследовании Л.Е. Сальниковой проанализирована связь 36 8МР с частотой ХА, определяемых в различных группах населения и профессионалов, подвергавшихся радиационному воздействию [14, 15]. Все ассоциативные связи 8МР с частотой и спектром ХА, были крайне вариабельны, имели низкий уровень доверительной вероятности (ни в одном случае уровень значимости не достигал величины <0.05 при использовании поправки на множественные сравнения) и, соответственно, не могли быть использованы для оценки вероятности риска индукции ХА при контакте с ИИ.
Для выявления молекулярно-генетических маркеров, которые могли бы использоваться для предсказания вероятности индукции цитогенети-ческих нарушений с повышенной частотой при контакте с ИИ, необходимо провести крупномасштабное исследование ассоциации большого количества 8МР с уровнем ХА. При этом важно проведение анализа на однородной выборке людей, подвергавшихся радиационному воздействию в диапазоне доз от 0.1 Гр и не превышающих 0.5 Гр. Последнее связано с тем, что именно для этого диапазона доз характерна наибольшая межиндивидуальная вариабельность уровней цитогенети-ческих нарушений, что, по-видимому, свидетельствует о существенной роли генотипической компоненты в радиочувствительности хромосом генома. С помощью технологии микроматриц нами проведено исследование связи 1 421 8МР с частотой и спектром ХА у работников Сибирского химического комбината (СХК), подвергавшихся хроническому внешнему радиационному воздействию.
В статье представлены результаты исследования, цель которого — выявление полиморфных вариантов генов, ассоциированных с повышенной частотой различных типов цитогенетиче-ских нарушений у облученных здоровых работников СХК.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования явилась кровь здоровых работников СХК — крупнейшего в мире предприятия атомной отрасли, подвергавшихся долговременному радиационному воздействию в процессе профессиональной деятельности. Для исследования была подобрана группа из 96 работников СХК. Критерии отбора были следующие:
1) Мужской пол.
2) Славянская национальность.
3) Возраст 45—65 лет.
4) Хроническое внешнее радиационное воздействие (у-излучение) в диапазоне доз 100— 300 мЗв.
Индивидуальный дозиметрический контроль персонала проводился с момента ввода в действие основных технологических процессов с 1953 г. В период 1958—1998 гг. в системе контроля индивидуальной дозы у-излучения применялся пленочный дозиметр, в период 1988—2003 гг. эксплуатировались термолюминесцентные дозиметры. С 1998 г. на СХК эксплуатируется автоматизированный комплекс индивидуальной дозиметрии с термолюминесцентными дозиметрами.
Для всех обследованных проведен анализ спектра и частоты ХА в лимфоцитах периферической крови (не менее чем по 300 метафазам) по стандартной методике. Для постановки культуры лимфоцитов использовали цельную кровь, которую смешивали с культуральной средой и инкубировали в культуральных флаконах при 37°С в суховоздушном термостате. Состав среды: 85% среды RPMI 1640, 15% эмбриональной телячьей сыворотки. 8 мл среды вносили в бакпечатки и добавляли 2 мл цельной крови и 2—2.5% фитоге-магглютинина ("Sigma", США). Культуральные флаконы культивировали 45 ч, потом добавляли колхицин до конечной концентрации 0.06 мкг/мл и культивировали еще 3 ч. Дальнейшую обработку лимфоцитов проводили по общепринятой методике: гипотонизация (в 0.56%-ном растворе KCl, содержащем 0.95% цитрата натрия), фиксация (смесью этанола и ледяной уксусной кислоты в соотношении 3 : 1), раскапывание клеточной суспензии на охлажденные и обезжиренные предметные стекла). Рутинную окраску хромосом проводили красителем Гимза, приготовленным на фосфатном буфере. Хромосомный анализ проводили на зашифрованных препаратах с помощью микроскопа "Leica DM25000" (Германия) при малом (10 х 10) и большом (10 х 100) увеличении. Отбор метафазных пластинок осуществляли с учетом следующих требований: цельность мета-фазной пластинки, четкость окраски, отсутствие или небольшое число (1—2) поперечных наложений хромосом, средняя степень их конденсации, обособленность метафазных пластинок друг от друга. Количество центромер — 46. У каждого индивида обследовали не менее 300 метафаз.
Анализировали все виды аберраций хромосом, распознаваемых без кариотипирования. Из аберраций хромосомного типа учитывали парные фрагменты, точечные парные фрагменты, кольцевые и дицентрические хромосомы. Оценивали число хроматидных фрагментов, одиночных точечных фрагментов и хроматидных обменов. Из стабильных аберраций регистрировали аномальные моноцентрики, являющиеся результатом ре-
ципрокной транслокации. Рассчитывали частоту аберрантных клеток и всех видов ХА в пересчете на 100 метафаз. Таким образом, анализировались частоты следующих цитогенетических нарушений: частота аберрантных клеток, частота хрома-тидных фрагментов, хроматидных обменов, парных фрагментов, точечных фрагментов, дицен-трических хромосом, кольцевых хромосом, частота транслокаций.
ДНК из крови выделяли при помощи колоночного метода, наборами "QIAamp DNA Mini Kit (50)" ("Qiagen", Германия). Концентрацию и чистоту ДНК проверяли на спектрофотометре "NanoDrop 1000" ("Thermo Scientific Electron", США). Средняя концентрация ДНК составила 450 нг/мкл (300—550 нг/мкл), показатели чистоты ДНК от белков и органических примесей: А260/А280 = 1.95-2.05; А26()/А230 = 2.00-2.30. Качество ДНК проверяли электрофорезом в агароз-ном геле.
Генотипирование проводили на микроматрице "Cancer_SNP_Panel GT-17-211" ("Illumina"). Эта микроматрица разработана по результатам Cancer Genome Anatomy Project (http://variant-gps.nci.nih.gov/cgfseq/pages/snp500.do). Она содержит 1 421 SNP-маркер 406 генов, из них: 136 SNP в 3'UTR, 33 SNP в 5'UTR, 109 SNP фланкирующих 3'UTR, 192 SNP фланкирующих 5'UTR, 645 интронных SNP и 306 в кодирующих регионах. (http : //www.illumina.com/documents/ products/datasheets/datasheet_cancer_snp_panel.pdf). Список исследованных генов представлен в табл. 1. Генотипирование было выполнено в соответствии с протоколом фирмы - производителя микроматрицы.
Анализ ассоциации уровней различных цито-генетических нарушений с полиморфными вариантами изучен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.