МИКРОБИОЛОГИЯ, 2013, том 82, № 4, с. 428-433
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 579.843.1.017.7:577.152.1
ОЦЕНКА ТОКСИЧНОСТИ ЖЕЛЕЗА С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА НА РЕКОМБИНАНТНОМ ШТАММЕ ESCHERICHIA COLI © 2013 г. Е. В. Сорокина, Т. П. Юдина, И. А. Бубнов, В. С. Данилов1
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет Поступила в редакцию 04.06.2012 г.
Исследовано токсическое действие ионов железа Fe2+ и Fe3+ на люминесцентном рекомбинантном штамме Escherichia coli с опероном luxCDABE в краткосрочном и длительном экспериментах. При 30 мин экспозиции ионов железа с бактериями эффективная концентрация для острой токсичности (ЕС50) для Fe2+ составляла 8.5 мг/л и для Fe3+ 1.3 мг/л. В долгосрочном (24 ч) опыте при активном росте бактерий максимальная величина индекса токсичности для Fe2+ достигала величины 65.5 и 62.8 для Fe3+. При этом внесение ионов железа в среду культивирования, несмотря на ингибиро-вание биолюминесценции, не приводило к снижению роста бактерий. Сравнительный анализ результатов длительного и краткосрочного экспериментов позволил оценить характер токсичности ионов железа в исследованном нами диапазоне концентраций от 0.5 до 20 мг/л рассчитанных по ионам Fe2+ и Fe3+. Обнаружено, что ионы железа оказывают влияние только на второстепенные для жизнедеятельности клетки реакции и не действуют негативно на генный аппарат и процессы биосинтеза белка, указывая на неспецифическую токсичность и Fe2+ и Fe3+.
Ключевые слова: биолюминесценция, рекомбинантный штамм Escherichia coli, токсичность, рост бактерий.
DOI: 10.7868/S0026365613040113
Известно, что железо в бактериях находится, в основном, в виде двух взаимно превращающихся ионов Fe2+ и Fe3+. Оба иона участвуют в катализе многочисленных биологических реакций, в том числе связанных с переносом электронов, и при функционировании ферментов в биосинтезе ге-мов [1]. Но, несмотря на важность железа для биологических систем, его количество в клетках должно поддерживаться на определенном низком уровне, поскольку в высоких концентрациях оно обладает токсическим действием. Катионы железа генерируют активные формы кислорода, что приводит к перекисному окислению липидов мембран клеток, повреждению ДНК и белков [2].
Морские люминесцентные бактерии широко используются в настоящие время в качестве быстрого теста для оценки интегральной токсичности химических соединений и их смесей [3]. Внесение химического соединения влияет на метаболизм бактерий, что существенно сказывается на активности фермента люциферазы и приводит к изменению интенсивности свечения клеток. Отклик люминесцентных бактерий на токсикант
1 Автор для корреспонденции (e-mail: vsdanil@mail.ru).
коррелирует с действием на высшие животные и культуры тканей человека [3, 4]. Для выяснения характера токсического действия химических соединений используют две модификации люминесцентного бактериального теста: в кратковременном опыте, 30 мин, выявляют неспецифическую токсичность, а в длительных экспериментах, проводимых на активно растущих культурах, выявляют специфическую токсичность химических соединений, действующих на процессы синтеза белка и генный аппарат клетки [5, 6]. Показано, что целый ряд соединений обладают слабой токсичностью при 30-минутной экспозиции, в то время как в длительном эксперименте их действующая концентрация может уменьшаться более чем в тысячу раз [7].
В развитие люминесцентного анализа, сохраняя достоинства этого метода, мы применяем в качестве тест-объекта рекомбинантный штамм E. coli со встроенными генами полного lux-оперона, который, в отличие от морских люминесцентных бактерий, не требует присутствия в среде хлорида натрия, искажающего показатели токсичности [7, 8].
В литературе показано влияние ионов железа на интенсивность свечения и рост люминесцентных бактерий, а также на культуры E. coli, как ре-
комбинантного, так и коллекционных штаммов. Оптимальный рост E. coli отмечается при концентрациях железа от 0.1 до 2.0 мг/л [9, 10]. При этом показано, что Fe2+ в концентрации 2.8 мг/л в среде культивирования обусловливает снижение роста бактерий Е. coli, а при концентрации 29 мг/л вызывает практически полное его ингибирование [11]. При оценке влияния ионов Fe3+ на рост люминесцентных бактерий Photobacterium phospho-reum в синтетической среде присутствие железа в концентрациях от 0.56 мкг/л до 56 мг/л не оказывало влияния на рост культуры до 9 ч роста: количество клеток было, как и в контрольных образцах [12]. При этом данные о влиянии железа на свечение бактерий противоречивы. Концентрация Fe3+ 56 мг/л приводила к незначительному снижению биолюминесценции бактерий [13]. Тушение свечения на 50% бактерий Vibrio fischeri в коммерческом препарате "Microtox" через 15 мин измерения наблюдалось при 7 мг/л Fe3+ [14]. Есть данные по влиянию ионов Fe2+ на коммерческий препарат "Эколюм" на основе рекомбинантного штамма Е. coli в краткосрочном опыте: концентрация железа 180 мг/л снижала биолюминесценцию E. coli только на 50% [15]. В то же время при действии на морских люминесцентных бактерий P. phosphoreum эти же концентрации вызывали активацию свечения [15]. Таким образом, противоречивость данных разных исследователей позволяет сделать вывод о неспецифическом токсическом действии железа при его кратковременном воздействии.
Целью настоящей работы было определение характеристики токсического действия ионов железа в краткосрочных опытах в режиме реального времени, а также в долгосрочных экспериментах для оценки его возможного специфического действия на люминесцентные бактерии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования для краткосрочных экспериментов. В экспериментах использовали бактериальный тест "Эколюм" ("Иммунотек", Москва) разработанный в лаборатории биологически активных веществ МГУ им. М.В. Ломоносова. Тест-система представляет собой лиофилизированные бактерии E. coli, К12 TGl(pFl) со встроенными генами полного CDABE lux-оперона люминесцентной системы из бактерии V. fischeri 6 МГУ [16].
Приготовление бактериального препарата для краткосрочных экспериментов. Во флакон с лио-фильно высушенными бактериями для их регидра-тации вносили 10 мл стерильной дистиллированной воды (рН 7.0) и получали "маточную суспензию". Из нее путем разбавления водой готовили рабочую суспензию бактерий с концентрацией клеток (2—3) х 108 кл/мл [16]. В экспериментах по
оценке влияния среды "маточную суспензию" центрифугировали при 6000 g 15 мин. Затем осадок клеток ресуспендировали в дистиллированной воде. Конечная концентрация клеток в пробе составляла (1.5—2) х 107 кл/мл.
Приготовление бактериальных препаратов для долгосрочных экспериментов. При проведении экспериментов использовали культуру бактерий E. coli TG1, выращенную в питательной среде LB [17]. Бактерии культивировали на качалке (180— 200 об/мин) при 27°C в колбах объемом 750 мл со 100 мл питательной среды в течение 8—9 ч. Выращенную культуру разливали во флаконы объемом 10 мл с токсикантом по 1.5 мл с плотностью клеток (1.5—2) х 104 кл/мл. В качестве токсикантов использовали соли FeSO4 • 7Н2О и FeCl3 • 6Н2О в диапазоне концентраций от 0.5 до 20 мг/л в расчете на ионы Fe2+ и Fe3+.
Опыт проводили в стационарных условиях при 25—26°С в течение 24 ч. Через каждые 2 ч флаконы использовали как образец в котором определяли рост культуры и интенсивность свечения бактерий [7].
Измерение люминесценции бактерий. Для измерения интенсивности свечения формировали пробу, которая содержала: (1) в краткосрочном эксперименте — 0.1 мл суспензии бактерий "Эколюм" и 0.9 мл дистиллированной воды или такой же объем токсиканта; (2) в долгосрочном эксперименте — 0.1 мл клеточной суспензии и 0.9 мл дистиллированной воды [15, 16].
Интенсивность биолюминесценции бактерий измеряли на люминометрах Luminometer 1251 BioOrbit (Финляндия) и "Биотокс-10" (Россия) в течение 30 мин в краткосрочном опыте и образцах, каждые 2 ч отобранных в хроническом эксперименте.
Определение индекса токсичности. Для определения индекса токсичности проводили параллельные измерения биолюминесценции контрольных (не содержащих токсических веществ) и опытных проб в трех повторностях. Погрешность всех измерений биолюминесценции метода не более 10%.
Индекс токсичности вычисляли по формуле: Т = 100 х (I0 — I)/I0, где I0 и I — интенсивность свечения контроля и опыта, соответственно, при фиксированном времени экспозиции.
Использовали общепринятые в токсикологии показатели эффективной концентрации ЕС20, вызывающей 20% ингибирование свечения бактерий, при которой образец признается токсичным; и ЕС50, вызывающей 50% ингибированда интенсивности свечения бактерий, при которой констатируют острую токсичность [4].
Вычисления ЕС50 проводили по Г-функции согласно формуле Г =100 х (I0 — It)/It, где I0 и It —
430
СОРОКИНА и др.
Индекс токсичности 80 г
0 5 10 15 20 25 30
Время, мин
Рис. 1. Зависимость величины индекса токсичности от времени инкубации клеток E. coli с ионами Fe2+ и их концентрации в краткосрочном опыте. Концентрации Fe2+, мг/л: 1 — кривая 1, 2 — кривая 2, 5 — кривая 3, 10 — кривая 4 и 20 — кривая 5.
интенсивность свечения в отсутствие и присутствии токсиканта [4, 8].
Определение роста клеток. Число бактериальных клеток определяли по показателю оптической плотности суспензии при X = 590 нм на (ФЭК "KF77", Польша) и рассчитывали по калибровочной кривой.
Реактивы: FeSO4 • 7Н2О, FeCl3 • 6Н2О марки х.ч. и ч.д.а., реактивы питательных сред фирмы "Difco".
Индекс токсичности
j_I_I_I_I_I
0 5 10 15 20 25 30
Время, мин
Рис. 2. Зависимость величины индекса токсичности от времени инкубации клеток E. coli с ионами Fe3+ в краткосрочном опыте. Концентрации Fe3+, мг/л: 0.1 — кривая 1, 0.5 — кривая 2, 1 — кривая 3, 2 — кривая 4 и 5 — кривая 5.
Индекс токсичности
100 г
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Концентрация, мг/л
Рис. 3. Зависимость величины индекса токсичности от концентраций ионов Fe2+ (1) и Fe3+ (2) в краткосрочном опыте при 30-мин экспозиции.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Оценка влияния ионов Fe2+ и Fe3+ на биолюминесценцию рекомби
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.