ОНТОГЕНЕЗ, 2014, том 45, № 3, с. 180-186
УДК 575.22;502.4
ОЦЕНКА ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКОЙ СТАБИЛЬНОСТИ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ НАЗЕМНЫХ МОЛЛЮСКОВ (НА ОСНОВЕ МЕТОДА ДНК-КОМЕТ) © 2014 г. Э. А. Снегин
Научно-исследовательская лаборатория популяционной генетики и генотоксикологии Белгородского государственного национального исследовательского университета 308014 Белгород, ул. Победы, д. 85 E-mail: snegin@bsu.edu.ru Поступила в редакцию 11.12.13 г. Окончательный вариант получен 14.01.14 г.
Методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (ДНК-комет) была оценена степень повреждения ядерной ДНК в популяциях наземных моллюсков Bradybaena fruticum Müll., Chondrula tridens Müll., Cepaea vindobonensis Fer. и Stenomphalia ravergieri Fer., обитающих в условиях лесостепного ландшафта юга Среднерусской возвышенности. Выявлены свидетельства наличия различий по исследуемым показателям. Отмечается возрастная динамика степени повреждения генетического аппарата. Обсуждаются возможные причины выявленных различий.
Ключевые слова: наземные моллюски, повреждение ДНК, метод ДНК-комет.
DOI: 10.7868/S0475145014030069
ВВЕДЕНИЕ
Различные техногенные факторы и химические агенты, которые действуют на ДНК живых организмов, могут искажать механизм передачи наследственной информации. Это, как известно, может привести к серьезным последствиям в нормальном функционировании существующих форм органического мира, включая и человека.
Из имеющегося в арсенале современных тест-систем для оценки уровня цитогенетической стабильности в условиях влияния различных ксенобиотиков весьма чувствительным является метод щелочного гель-электрофореза изолированных клеток, получивший сокращенное название метод ДНК-комет (Comet assay) (Ostling, Johanson, 1984; Тронов, Пелевина, 1996; Olive, Banath, 2006; Сорочинская, Михайленко, 2008; Dhawan, Anderson, 2009). В подавляющем большинстве случаев этот подход используется в лабораторных экспериментах в условиях in vitro и in vivo. Но, постепенно появляются сведения о применении этого метода для определения степени мутагенной нагрузки в различных ландшафтах (Shugart, 2000; Regoli et al., 2004; Mitchelmore C.L. et al., 2004; Слободскова и др., 2011). В этой связи возникает вопрос о приемлемых организмах-биоиндикаторах, способных стать объектами экотоксикологи-ческого мониторинга. В качестве таковых мы
предлагаем использовать наземных брюхоногих моллюсков.
Цель настоящей работы состояла в оценке уровня цитогенетической стабильности природных популяций животных юга Среднерусской возвышенности путем изучения реакции организмов на генотоксичные факторы среды методом ДНК-комет. В данном исследовании были задействованы аборигенные для района исследования виды наземных моллюсков: Bradybaena (Fruticicola)fruticum Müll. (кустарниковая улитка), Chondrula tridens Müll., (улитка трехзубая) и Cepaea vindobonensis Fer. (улитка австрийская). Выбор этих организмов обусловлен несколькими причинами.
Во-первых, названные виды, обладая ярко выраженным полиморфизмом конхиологических и биохимических признаков, давно используются в качестве биоиндикаторов антропогенного воздействия на биоценозы в различных ландшафтах (Матекин, 1950; Макеева и др. 2005; Крамаренко и др., 2007; Снегин 2010, 2011а, б).
Во-вторых, в местах обитания они образуют многочисленные колонии и широко распространены на европейском континенте, что позволяет получить репрезентативный материал.
В-третьих, кустарниковая и австрийская улитки являются относительно долгоживущими (до
Рис. 1. Пункты сбора моллюсков.
5 лет) и малоподвижными животными, привязанными своей биологией к определенной растительности и почвам. Все это способствует накоплению в их теле различных поллютантов, включая и генотоксичные компоненты.
Кроме того, нами был проведен анализ одной колонии адвентивной северокавказской улитки Stenomphalia ravergieri Fer.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Исследования проводились на территории юга Среднерусской возвышенности (Белгородская область) в летний сезон 2011 г. Улитки собирались вручную в местах обитания. Для сбора Ch. tridens применялся метод кошения сачком. Из каждой популяции случайным образом отбиралось по десять особей для лабораторных исследований. Анализировались в основном половозрелые моллюски, закончившие рост, о чем свидетельствовал отворот устья на раковине. Всего было исследовано 150 особей из пятнадцати пунктов (рис. 1), описание которых приводится в табл. 1.
Метод ДНК-комет. Стоит отметить, что одним из ключевых моментов использования этого метода для анализа природных популяций, на наш взгляд, является время, прошедшее с момента сбора животных, до проведения собственно анализа. Судя по публикациям, как, например, в работе В.В. Слободсковой и др. (2011), авторы выдерживали животных в лаборатории после сбора до двух суток. Однако, по нашим данным, если
анализируемые организмы находятся вне своей
1
среды обитания более суток , то за это время происходит, либо полная репарация поврежденной ДНК (если таковая была), либо удаление из организма клеток с сильно разрушенной ДНК и находящихся в состоянии апоптоза. Эти факторы могут сильно исказить реальную картину. Поэтому мы считаем, что анализ необходимо проводить как можно быстрее после изъятия организмов, используя при этом полевые лаборатории. Полагаем также, что если проведение анализа затруднено (например, из-за пространственной удаленности лаборатории), то для транспортировки животных необходимо использовать матерчатые мешки, или стеклянные банки, куда помещаются кусочки почвы, лиственный опад и наземные части кормовых растений, взятых из обследуемого биотопа. Транспортировку улиток следует проводить в прохладном месте.
В наших исследованиях животные анализировались в день сбора. Для анализа использовали ткань гепатопанкриеса. Мацерация проходила в фосфато-солевом буфере (рН 7.5) содержащем 20 мM EDTA-Na2 и 10% ДМСО при температуре +4°С. Клеточные суспензии в составе легкоплавкой агарозы наносили на предметные стекла
1 В ходе лабораторных экспериментов, проводимых в условиях in vivo, нами было зафиксировано, что если с момента воздействия мутагена (метилметансульфонат) проходит более 20-ти часов, то количество отмечаемых ДНК-комет резко снижается.
Таблица 1. Описание пунктов сбора
Пункт Описание биотопа Координаты
1 Памятник природы "Ясный колодец", пойма р. Короча, окрестности г. Короча. Опушка черноольшанника 50°49'34.23" c.m. 37°12'34.24" в.д.
2 Пойма реки Корень, окрестности пос. Алексеевка (Корочанский район). Заросли ивы 50°45'19.01" c.m. 37°01'30.91" в.д.
3 Пойма р. Пена, окрестности пос. Сырцево (Ивнянский район). Заросли ивы и клена 50°53'48.79" c.m. 36°15'32.43" в.д.
4 Пойма р. Нежеголь, территория г. Шебекино. Ивовый лес 50°24'32.93" c.m. 36°52'38.38" в.д.
5 Пойма р. Северский Донец, окрестности г. Белгород. Заросли ивы и клена 50°36'38.40" c.m. 36°37'19.19" в.д.
6 Заповедный участок "Стенки Изгорья", долина р. Оскол, окраина чернооль-шанника (Новооскольский район) 50°41'22.60" c.m. 37°49'12.67" в.д.
7 Пойма р. Ворскла, территория пос. Борисовка, под автомобильным мостом 50°36'32.25" c.m. 36°00'21.33" в.д.
8 Пойма р. Осколец, окрестности д. Стойло, территория Стойленского ГОК (Губкинский район), заросли ивы 51°17'24.75" c.m. 37°44'05.57" в.д.
9 Рекультивированные отвалы Стойленского ГОК (точка 1, Губкинский район) 51°17'18.18" c.m. 37°40'56.29" в.д.
10 Рекультивированные отвалы Стойленского ГОК (точка 2, Губкинский район) 51°17'04.37" c.m. 37°42'59.01" в.д.
11 г. Белгород, газон возле старого корпуса БелГУ, посадки каштанов и елей 50°37'16.58" c.m. 36°34'36.25" в.д.
12 Заповедный участок "Стенки Изгорья", меловой склон на северной окраине, долина р. Оскол (Новооскольский район) 50°41'24.42" c.m. 37°49'34.22" в.д.
13 Долина р. Валуй, подножие мелового склона, окрестности г. Валуйки, рядом с автомобильной трассой 50°13'24.38" c.m. 38°00'34.61" в.д.
14 Памятник природы "Бекарюковский бор", пойма р. Нежеголь (Шебекинский район), посадки клена и меловой склон вблизи автомобильной трассы 50°25'43.87" c.m. 37°04'12.07" в.д.
15 г. Белгород, заросли кустарников у обочины трассы Москва—Семферополь 50°35'24.14" c.m. 36°34'13.35" в.д.
с агарозной подложкой при температуре +42°C. Лизис белков проходил два часа при температуре +4°C (лизирующий буфер: 10 mM Tris-HCl (pH 10), 2.5 M NaCl, 100 mM EDTA-Na2, 1% Triton X-100 и 10% ДМСО). Электрофорез проводили в темном помещении, применяя нейтральную версию метода с использованием трис-ЭДТА-боратного буфера (рН 8.9; 20 мин; 1 в/см). Фиксированные спиртом и высушенные препараты окрашивали красителем SYBR Creen I. Анализ изображений проводился на эпифлуорес-центном микроскопе. Данные обрабатывались
2
при помощи программы CometScore™ v. 1.5 . Ядра ранжировались по четырем стадиям разруше-
' http://www.autocomet.com/products_cometscore. php
ния ДНК. На каждом препарате учитывалось не менее 100 ядер (рис. 2).
Степень поврежденности ДНК мы оценивали с использованием критерия Краскела-Уоллиса, который иногда выражается как индекс "ДНК-комет" (ИДК), по формуле:
ИДК = (0n0 + 1n1 + 2n2 + 3n3 + 4n4)/^,
где n0—n4 — число "ДНК-комет" каждого типа, ^ — сумма подсчитанных "ДНК-комет" (Struwe е! al., 2007).
Кроме того, для расчетов был использован непараметрический критерий Даннета ("% ДНК в хвосте" — % DNAt и "Момент хвоста" — tM, (Olive е! al., 1990; Chaubey, 2005; Francesconi е! al., 2001),
Рис. 2. Изображение ДНК-комет клеток гепатопанкриеса Br. fruticum (на фотографии видны ядра на различных стадиях разрушения, 1 — ядро клетки в состоянии апоптоза).
а так же высчитывался процент клеток, находившихся в состоянии апоптоза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Согласно проведенным ранее исследованиям в изучаемых популяциях моллюсков мы наблюдали уменьшение фенотипического и аллельного разнообразия, а также сокращение количества комбинаций и увеличение коэффициента инбридинга (Снегин 2010, 2011а, б; Снегин и др., 2012). По нашим данным, такие генетико-эрозионные процессы вызваны крайней расчлененностью видового населения моллюсков в условиях лесос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.