МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2014, том 48, № 3, с. 429-435
МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 57.085.25
ОТСРОЧЕННЫЙ ЭФФЕКТ УВЕЛИЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ЦИТОКИНОВ ПОСЛЕ ГИПЕРТЕРМИЧЕСКОГО ВОЗДЕЙСТВИЯ*
© 2014 г. K. Kinoshita*, A. Sakurai, J. Yamaguchi, M. Furukawa, K. Tanjoh
Division of Emergency and Critical Care Medicine, Department of Acute Medicine, Nihon University School of Medicine, Tokyo, 173-8610 Japan Поступила в редакцию 25.09.2013 г. Принята к печати 19.12.2013 г.
Тепловой удар считается одним из факторов, приводящих к повреждению эндотелиальных клеток. Цель данной работы — изучение временных профилей продукции цитокинов (IL-6 и IL-8) и их мРНК эндоте-лиальными клетками, которые подвергли действию повышенных температур. Первую группу эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC) культивировали при четырех различных температурах (37, 38, 39 или 40°C) в течение 1 ч, 3 ч и 5 ч. Во второй группе клетки HUVEC культивировали при 37°C в течение 4 ч или 23 ч после предварительного прогревания в течение 1 ч при тех же температурах, что и в первой группе (от 37 до 40°C). После этих процедур измеряли содержание белков IL-6 и IL-8 и соответствующих им мРНК. Выявлено, что в клетках, культивируемых при повышенной температуре (39°C и 40°C), содержание IL-6 и 8 достоверно ниже (p < 0.001), чем в клетках, которые росли при 37°C (в контроле); причем снижение количества белка было температурно-зависимым. Однако через 23 ч после кратковременного гипертермического воздействия (40°C, 1 ч) на клетки содержание IL-6 и IL-8 было достоверно выше, чем в контроле (p < 0.001). Таким образом, после кратковременной гипертермии продукция цитокинов эндотелиальными клетками сначала снижалась, а затем увеличивалась. Во всех группах клеток через 24 ч после теплового воздействия содержание мРНК IL-6 и IL 8 было достоверно выше (p < < 0.001), чем в контроле (37°C). На основании полученных результатов можно предполагать, что после прекращения гипертермии повреждение тканей продолжает развиваться — так что есть определенный риск недооценки значимости индуцированного цитокинами повреждения тканей в острой фазе гипертермии.
Ключевые слова: тепловой удар, цитокины, эндотелиальные клетки, интерлейкины, мРНК, посттрансляционная модуляция.
DELAYED AUGMENTATION EFFECT OF CYTOKINE PRODUCTION AFTER HYPERTHERMIA STIMULI, by K. Kinoshita*, A. Sakurai, J. Yamaguchi, M. Furukawa, K. Tanjoh (Division of Emergency and Critical Care Medicine, Department of Acute Medicine, Nihon University School of Medicine, Tokyo, 1738610 Japan; *E-mail: kinoshita.kosaku@nihon-u.ac.jp). Heatstroke is considered an important condition that may contribute to endothelial cell damage. The aim of this study was to assess temporal profiles of the cytokine (IL-6 and IL-8) and mRNA production when endothelial cells undergo higher temperature stimuli. In the first group, human umbilical vascular endothelial cells (HUVECs) were cultured at 4 different temperatures (37, 38, 39 or 40°C) for 1, 3 and 5 h. In the second group, HUVECs were cultured at 37°C for 4 h or 23 h, after stimulation by heating for one hour at the same culture temperatures used in the first group (37°C to 40°C). After culturing, IL-6 andIL-8 mRNA and protein levels were measured. It has been found the cytokine mRNA levels being significantly higher (p < 0.001) in all cells incubated at higher temperatures than those in the control (cultivation at 37°C). At the same time, the productionofIL-6 and 8 at a higher temperature (39, 40°C) was significantly lower (p < 0.001) than at 37°C (control), and the decrease was temperature dependent. However, IL-6 andIL-8 levels were significantly greater in the cells at 23 h after transient hyperthermic (40 °C, 1 h) stimulation than in control ones (p < 0.001).After a transient hyperthermia, the production of the cytokines in HUVECs is initially inhibited and then augmented. The results indicated that tissue injury might continue to develop after a hyperthermic event. There might be a potent risk for underestimation of cytokine induced tissue injury in the acute phase of a heatstroke.
Keywords: heatstroke, cytokine, endothelial cells, interleukin, mRNA, posttranslational modulation. DOI: 10.7868/S0026898414030100
# Статья представлена на английском языке.
* E-mail: kinoshita.kosaku@nihon-u.ac.jp
ВВЕДЕНИЕ
Температуру считают важным фактором, который может способствовать полиорганной недостаточности, связанной с повреждением эндотели-альных клеток у пациентов, получивших тепловой удар. Мы сообщали, что гипотермия приводит к снижению высвобождения цитокинов при различных низких температурах в системах in vivo [1, 2] и in vitro [3]. Хотя известно, что основные производители цитокинов — это моноциты и макрофаги, и продукция цитокинов при гипотермии заметно снижается [4, 5], остается неясным, как продукция цитокинов в эндотелиальных клетках изменяется после гипертермической стимуляции. Повышение температуры тела, скажем, при тепловом ударе, регулирует экспрессию провоспалительно-го цитокина — фактора некроза опухолей альфа (TNFa) [6—8], ограничивая продукцию TNFa клетками Купфера в печени кратким всплеском [8]. Замечено, что у пациентов, получивших тепловой удар, увеличены уровни про- и противовоспалительных цитокинов, белков острой фазы, усилен лейкоцитоз и активация эндотелиальных клеток — предположительно, из-за повышения продукции циркулирующих маркеров, таких как антиген фактора фон Виллебранда, молекул межклеточной адгезии и растворимого тромбомоду-лина [9—12]. Воспалительная реакция сохранялась при легкой гипертермии и усиливалась в более тяжелых случаях [10—15]. Сепсис — серьезное осложнение после теплового удара, и для пациентов с гипертермией подробно описаны изменения в уровнях провоспалительных цитокинов, таких как IL-6 и IL-8 [10, 13]. Не исключено, что гипертермия вызывает травмы микрососудов [16, 17]. В частности, показано привлечение нейтрофилов эндогенным IL-8, который представляет собой ключевой медиатор хемотаксической активности нейтрофилов [18, 19]. Активация нейтрофилов и привлечение их к эндотелию может играть существенную роль в развитии воспаления после теплового удара. Мы предположили, что эндотели-альные клетки могут обладать зависимыми от температуры механизмами высвобождения цито-кинов и изменения их экспрессии при гипертермическом воздействии. В данном исследовании мы оценили временные профили продукции цитокинов (IL-6 и IL-8) и их мРНК при гипертермическом воздействии на эндотелиальные клетки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Клеточные культуры. Эндотелиальные клетки пупочной вены человека (ИиУБС) ('^оп2а, Wаlk-егзуШе", США) поддерживали в монослое в среде EGM-2 ('Топ2а, WaIkersviIIe") при 37°С во влажной атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Клетки пересевали при достижении 70—80% кон-
флюэнтности и поддерживали не дольше 4 недель.
Экспериментальные группы. Клетки HUVEC (5 х 105 клеток/лунку, n = 6 лунок для каждой параллели) выдерживали при 37°C в среде EBM-2 и инкубировали в течение 48 ч, после чего среду заменяли на Medium 199 ("Invitrogen", США) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки [3].
В первой группе клетки HUVEC затем культивировали при четырех различных температурах (37, 38, 39 или 40°C) в течение 1 ч, 3 ч и 5 ч.
Во второй группе анализировали продукцию цитокинов IL-6 и IL-8 в клетках HUVEC после кратковременного температурного воздействия. Клетки культивировали при 37°C в течение 4 ч или 23 ч после 1-часового прогрева при тех же температурах, что и в первой группе клеток (37, 38, 39 либо 40°C). С целью исключить возможный сдвиг в продукции цитокинов из-за различий в "возрасте", клетки второй группы культивировали 5 ч либо 24 ч и затем сравнивали с первой группой. Две изучаемые группы названы "1 ч + 4 ч (37°С)" и "1 ч + 23 ч (37°C)", что означает культивирование клеток при 37°C в течение соответственно 4 ч и 23 ч после одночасового прогрева при 37, 38, 39 или 40°C.
Иммуноферментный анализ (ИФА). После инкубации супернатанты хранили при — 80° C для последующего количественного определения в них уровней IL-6 и IL-8 с использованием коммерческого набора Quantikine Human Cytokine Immunoassay ("R&D Systems, Minn.", США) в соответствии с инструкцией производителя.
Выделение РНК и обратная транкрипция. Суммарную РНК выделяли из клеток с помощью системы очистки РНК Micro-to-Midi Total RNA Purification System ("Invitrogen") согласно инструкции производителя. Обратную транскрипцию суммарной РНК (500 нг) проводили по инструкции производителя с использованием набора для обратной транскрипции Takara RNA PCR (AMV), версия 3.0 ("Takara Bio Co.", Япония), и случайных 9-меров ("Takara Bio Co.") в качестве прайме-ров. По завершении реакции объем смеси доводили дистиллированной водой до 10 мкл; каждая реакционная смесь для проведения ПЦР содержала 1 мкл кДНК.
Количественный анализ методом ОТ-ПЦР по технологии TaqMan®. Набор для анализа экспрессии генов Assay-on-Demand™ (праймеры, перекрывающие экзоны, и зонд, связывающийся с малой бороздкой, для ОТ-ПЦР в реальном времени) приобретен у компании "Applied Biosystems" (США) вместе с праймерами для гена "домашнего хозяйства" 18s (ID Hs99999901_s1), IL-8 (Hs00174103_m1) и IL-6 (Hs00174131_m1). Праймеры и зонды смешивали с реактивом TaqMan PCR Master MIX ("Applied Biosystems") в соответ-
IL-8 пг/мл 700
□ 370С
6°° - И380С 500 ^ И 390С
□ 400С 400 40 С
300
200
100
0
1 ч
#
1
#
I—I
т #
in 1—1
H * #
3 ч
5 ч
1 ч + 4 ч (370С)
IL-6 пг/мл 100
80 б0 40 20 0
1 ч
3 ч
5 ч
1 ч + 4 ч (370С)
Рис. 1. Изменение конститутивной экспрессии белков !Ь-6 и ГЬ-8 в клетках НЦУБС, культивированных при 4-х различных температурах (37°С, контроль; 38, 39 и 40°С) в течение 1 ч, 3 ч или 5 ч. Здесь и везде: подпись "1 ч + 4 ч (37°С)" относится к клеткам, культивированным при 37°С в течение 4 ч после 1-часового нагревания при 37, 38, 39 или 40°С. В клетках, культивируемых 5 ч при четырех различных температурах, или в группе "1 И + 4 И (37°С)" наблюдается значимое температурно-зависимое снижение уровн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.