научная статья по теме ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТОК ACHOLEPLASMA LAIDLAWII PG8 НА ХОЛОДОВОЙ ШОК И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС: ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ И СТРЕСС-РЕАКТИВНЫЕ БЕЛКИ МИКОПЛАЗМЫ Математика

Текст научной статьи на тему «ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТОК ACHOLEPLASMA LAIDLAWII PG8 НА ХОЛОДОВОЙ ШОК И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС: ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ И СТРЕСС-РЕАКТИВНЫЕ БЕЛКИ МИКОПЛАЗМЫ»

ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2010, том 432, № 5, с. 708-711

БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, ^^^^^^^^^^ МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ

УДК 579.8.05

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТОК ACHOLEPLASMA Ь\ГОЬ\Ш! PG8 НА ХОЛОДОВОЙ ШОК И ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ СТРЕСС: ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ И СТРЕСС-РЕАКТИВНЫЕ БЕЛКИ

МИКОПЛАЗМЫ

© 2010 г. В. М. Чернов, О. А. Чернова, Е. С. Медведева, А. И. Сорвина, М. Н. Давыдова, М. А. Рогова, М. В. Серебрякова

Представлено академиком И.А. Тарчевским 24.11.2009 г. Поступило 27.11.2009 г.

Большой объем экспериментальных и теоретических данных, полученных в разных лабораториях мира за последние годы, значительно расширил представления о биологии микоплазм (класс МоШси1е8) — мельчайших бактерий, способных к самостоятельному воспроизведению. Однако в исследовании молекулярных основ адаптации этих микроорганизмов к стрессорам сделаны лишь первые шаги [1]. Уникальным видом микоплазм с точки зрения адаптивных способностей является ЛсИо1ер1а8ша 1а1ё1ат1. Эта микоплазма, встречающаяся в почве, компосте и сточных водах, может инфицировать человека, животных, растения и контаминировать клеточные культуры, использующиеся в том числе для производства вирусных вакцин [2]. Реализация вирулентности Л. Ыё1аш1 (инфекционность, ин-вазивность, токсигенность, персистенция) предполагает успешное преодоление микоплазмой воздействия стрессовых факторов, связанных, прежде всего, с окислительным стрессом и изменениями температуры среды обитания бактерии. Показано, что некоторые стресс-индуцирован-ные белки могут быть основными элементами адаптации к неблагоприятным условиям среды и вирулентности бактерий [3]. Выявление таких белков представляет значительный интерес для фундаментальных и практических исследований молекулярных основ формирования системы "паразит—хозяин" и способов ее контроля.

Протеомный анализ, основанный на методах двумерного электрофореза, масс-спектрометрии и хромато-масс-спектрометрии белков, а также данных расшифрованного генома бактерий, яв-

Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской Академии наук Научно-исследовательский институт физико-химической медицины, Москва

ляется в настоящее время эффективным инструментом исследований модуляции экспрессии белков микроорганизмов в ответ на разные стрессоры для выяснения молекулярно-генетических основ выживания бактерий в различных условиях среды [4]. Однако в отношении "вездесущей" ми-коплазмы — Л. Ыё1аш1 — соответствующие исследования не проводились.

Задачей данной работы явилось выявление белков Л. Ыё1аш1 РОБ, дифференциально экс-прессирующихся в ответ на холодовой шок и окислительный стресс, в результате решения которой впервые представлены данные протеомно-го анализа клеток микоплазмы, культивируемых в стрессовых условиях — при холодовом шоке и окислительном стрессе, и идентифицированы стресс-реактивные белки бактерии.

В работе был использован штамм Л. Ыё1ат1 РО8, полученный из коллекции НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи (РАМН, Москва). Клетки микоплазм выращивали при 37°С в жидкой питательной среде Эдварда с модификациями [2]. Для сравнительных исследований протеомов Л. Ыё1ат1 РОБ до и после воздействия стрессоров клетки микоплазмы, культивируемые на полноценной питательной среде Эдварда при 37°С, подвергали на средней экспоненциальной фазе роста холодовому шоку (понижение температуры до 8°С в течение 2 ч) или окислительному стрессу (инкубирование ми-коплазм в питательной среде с добавлением Н2О2 до конечной концентрации 1 мМ в течение 20 мин). Клетки осаждали центрифугированием 12000 об/мин при 4°С в течение 20 мин; осадок дважды промывали в среде, содержащей 150 мМ ШС1, 50 мМ трис, 2 мМ М§С12, рН 7.4, и хранили при —80°С.

Белки разделяли с помощью 2ДЕ по [5], окрашивали серебром [6], а также флуоресцентными красителями CyDye-DIОE Су3 и CyDye-DIОE Су5 ("ЛшегеИаш"), позволяющими сравнительно

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТОК 709

(a)

Градиент pH 10 3 ГрадиентрН 10

« ч

е

1-е

и и

я

а р

т н е я н

о

т н е и

ади р

Г

« ч

е

1-е

и и

я

а

н е я н

о м

т н е

и

д

а р

Г

1 8

- -202 т Г.

2з ^Шй 18 19

12 1

911 I

0

4 5 -13

Г * ' . -1б ■

7

14

15

1

| 8 911

. - 2°2: ~ 23 • 4 12 10 В - . 45 -13 1 4 1б ■

25 , « ' 7 1 2 14 6 2

\ -15

(б)

3 Градиент pH 10 3 Градиент pH 10

8

911 I I

■ 12 10 - 2022 1

24-

JJ*' * |

Г 4 5 -

13

25 6

7

15

2

6

1

2

Рис. 1. 2D-электрофореграмма CHAPS-растворимых белков клеток экспоненциально растущей культуры А. ЫШа'ГО Р08 до — справа и после — слева воздействия стрессоров. а — окислительный стресс, б — холодовой шок. Стрелками и цифрами обозначены дифференциально экспрессированные белки микоплазмы.

быстро выявлять белковые пятна с дифференциальной экспрессией [7]. Сканирование гелей проводили на Typhoon Trio Scanner ("Amersham Bioscience") при интенсивности красного и зеленого лазеров 600 ptm. Полученные данные анализировали с помощью программы Phoretix 2D Advanced v6.01 (Nonlinear Dynamics Ltd., Newcastle upon Tyne, UK). Белки идентифицировали посредством масс-спектрометрии, а также хромато-масс-спектрометрии согласно [8]. Для обработки данных использовали программу Mascot Peptide

Fingerprint ("Matrix Science", USA); предел отсечения составлял > 44 (p < 0.05).

При 2DЕ-разделении в диапазоне рН 3—10 CHAPS-растворимой фракции белков клеток экспоненциально растущей культуры A. laidlawii PG8 было выявлено 362 белковых пятна. Результаты протеомного анализа клеток A. laidlawii PG8 до и после воздействия стрессоров представлены на рис. 1 и в табл. 1.

Изменение уровня экспрессии относительно контроля (>1.5) было обнаружено для 24 белковых пятен в случае окислительного стресса и 24 —

710 ЧЕРНОВ и др.

Таблица 1. Стресс-индуцируемые белки A. laidlawii PG8

- о Дифференциаль-

о й W К лт Функциональная Название белка № NCBI score5 Мол. pI ная экспрессия2

масса,

В « ю с категория (СОО) Да ОС3 ХШ4

t 2

1 Транскрипция в-субъединица РНК-поли-меразы (RpoB) GI:1624 47041 302 141 351 5.71 1.5 1.5

2 Транскрипционный регулятор, MarR-семейство (Mar) GI: 1624 47905 140 14582 4.96 1.7 1.5

3 Трансляция Фактор элонгации Tu (TufB) GI: 1624 47058 136 42824 5.21 1.5 1.6

4 Рибосомный белок S1 (RpsA) GI: 1624 47732 269 54069 6.07 1.6 1.5

5 Рибосомный белок S1 (RpsA) GI: 1624 216 54069 6.07 1.5 1.5

47732

6 Рибосомный белок L7/L12 (RplL) GI: 1624 47039 92 13091 4.86 1.7 1.8

7 Пептид-деформилаза (PDF) GI: 1624 48037 95 21633 5.13 1.5 1.6

8 Защитные механизмы Эндопептидаза La (Lon) GI: 1624 47398 397 86639 5.76 1.3 1.5

9 Альдегид-, алкоголь-дегид-рогеназа (AAD) GI: 1624 47047 198 95048 6.80 1.5 1.5

10 Альдегид-, алкоголь-дегид-рогеназа (AAD) GI: 1624 47047 245 95048 6.80 1.5 1.5

11 Альдегид-, алкоголь-дегид-рогеназа (AAD) GI: 1624 47047 242 95048 6.80 1.7 1.6

12 а-амилаза (AmyA) GI: 1624 47517 319 71136 6.04 1.8 1.7

13 Серин-гидрокси-метил-трансфераза (GlyA) GI: 1624 46933 175 45296 7.18 1.7 1.1

14 Супероксиддисмутаза, Fe/Mn (SodA) GI: 1624 47168 66 22826 6.18 1.5 1.5

15 Белок теплового шока Hsp20 (Hsp20) GI: 1624 47286 129 16044 5.69 1.5 1.5

16 Энергообразование, транспорт и обмен углеводов Глицеральдегид-3-фосфатде-гидрогеназа (GAPDH) GI: 1624 48019 184 35648 5.78 1.9 1.6

17 Фосфоглицераткиназа (Pgk) GI: 1624 48052 366 42 741 5.43 1.7 1.6

18 Фосфоглицераткиназа (Pgk) GI: 1624 48052 377 42 741 5.43 1.9 1.8

19 Фосфоглицераткиназа (Pgk) GI: 1624 48052 374 42 741 5.43 1.5 1.6

20 Фосфоглицератмутаза (Pgm) GI: 1624 47265 202 55799 5.58 1.5 1.6

21 Фосфоглицератмутаза (Pgm) GI: 1624 47265 193 55799 5.58 1.6 1.7

22 Фосфоглицератмутаза (Pgm) GI: 1624 47265 276 55799 5.58 1.6 1.7

23 Енолаза (Eno) GI: 1624 275 46488 4.97 1.7 1.5

47267

24 Транспортная система АВС-типа, субстратсвязывающий компонент (ACL_1410) GI: 1624 48245 267 54628 5 1.6 1.6

25 Гипотетические белки Гипотетический белок (ACL_0483) GI: 1624 47346 106 24365 4.98 1.5 1.5

1 Номер белкового пятна на 2В-электрофореграмме (рис. 1). 2 Жирный или обычный шрифты обозначают кратность изменения экспрессии белка: увеличение или уменьшение соответственно. 3 ОС — окислительный стресс. 4 ХШ — холодовой шок. 5 Score — вероятность, см. методику.

в случае холодового шока. В результате иденти- экспрессии RpoB, Mar, TufB, RpsA, RplL, PDF,

фикации экстрагированных из геля соответству- AAD, AmyA, Hsp20, GAPDH, Pgk, Pgm, Eno,

ющих белковых пятен установлено, что в ответ на ACL_1410, GlyA, SodA, ACL_0483. Изменение

окислительный стресс происходит модуляция экспрессии этих белков, а также Lon наблюдается

ОТВЕТНЫЕ РЕАКЦИИ КЛЕТОК

711

и при ответных реакциях A. laidlawii PG8 на холо-довой шок. При этом RpsA, AAD, Pgk и Pgm экс-прессируются как множественные изоформы, что может отражать их различные ко- и посттрансляционные модификации [8].

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют, что белки RpoB, Mar, TufB, RpsA, RplL, PDF, AAD, AmyA, Hsp20, GAPDH, Pgk, Pgm, Eno, ACL_1410, SodA и ACL_0483 являются общими (универсальными) стресс-индуцируемыми белками A. laidlawii PG8. Аналогичные изменения экспрессии этих белков в клетках микоплазмы наблюдаются в ответ на окислительный стресс и холодовой шок, что может быть обусловлено индукцией у бактерий окислительного стресса холодовым шоком [9].

Результаты анализа особенностей экспрессии белков A. laidlawii PG8 с точки зрения их функциональной категории свидетельствуют, что в стрессовых условиях понижается уровень экспрессии ферментов, участвующих в энергообразовании, транспорте и обмене углеводов, но усиливается экспрессия белков, определяющих защитные реакции клеток. Это альдегид-, алкоголь-дегидро-геназа (AAD) — фермент, обеспечивающий деток-сикацию и преобразование активных форм кислорода (АФК) в нерадикальные формы [10]; сериновая протеаза La (Lon), определяющая деградацию дефектных белков [11]; а-амилаза (AmyA), обусловливающая синтез трегалозы, которая у бактерий участвует в стабилизации белков, поддержании структурной целостности и функциональной активности клеточной мембраны [12]; а также транскрипционный регулятор Mar,

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком