ОНТОГЕНЕЗ, 2015, том 46, № 1, с. 38-43
БИОХИМИЯ РАЗВИТИЯ
УДК 547
ОВАРИАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ РЫБ СОДЕРЖИТ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕАЗ
© 2015 г. А. А. Минин, С. Г. Озерова
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН 117808, Москва, ул. Вавилова, д. 26 E-mail: mininand2010@gmail.com Поступила в редакцию 13.08.2014 г. Окончательный вариант получен 05.09.2014 г.
Исследования условий, при которых происходит спонтанная, без участия спермия, активации яйца рыб, показали, что яйцо хорошо сохраняет способность к оплодотворению в овариальной (полостной) жидкости, в которой оно находится в полости гонады после овуляции. Нами ранее было обнаружено, что в искусственных средах спонтанная активация подавляется ингибиторами протеаз. В настоящей работе было исследовано наличии природных ингибиторов протеаз в овариальной жидкости, показано, что в полостной жидкости данио и вьюна содержатся ингибиторы протеаз, в частности, белковый ингибитор трипсиновых протеаз серпин а первого типа.
Ключевые слова: активация яйца, ингибиторы протеаз, Misgurnus fossilis, Brahidanio rerio, серпина1.
DOI: 10.7868/S0475145015010061
При половом размножении животных активация — включение программы развития зиготы — происходит обычно при взаимодействии яйца со спермием. Одним из ранних событий при активации является формирование так называемой оболочки оплодотворения в результате экзоцитоза кортикальных гранул, которое инициируется у большинства групп животных проникновением спермия в яйцо и служит для предотвращения полиспермии. Однако процесс активации яйца у рыб имеет некоторые уникальные особенности.
Известно, что яйцо большинства рыб в нерестовой среде сохраняет способность к оплодотворению на протяжении ограниченного времени, характерного для каждого вида, что связано с так называемой спонтанной, т.е. не требующей спермия, активацией, характерной для этой группы позвоночных. Условия, при которых происходит активация и оплодотворение яиц у разных видов рыб, были подробно рассмотрены и описаны в монографии А.С. Гинзбург (Гинзбург А.С., 1968). Спонтанная активация, как и нормальная, сопровождается образованием оболочки оплодотворения, предотвращающей проникновение спермиев в яйцо. Для рыб характерно внешнее оплодотворение, поэтому процесс спонтанной активации, который запускается при попадании яйца в нерестовую среду, определяет время возможного оплодотворения. Важно отметить при этом, что в гонадах рыб при созревании и овуляции икра может до нереста какое-то время сохранять способность к оплодотворению, находясь при этом в специфической среде, образующейся из содержимого
лопнувших фолликулов и тканевой жидкости в полости гонады. А.С. Гинцбург рекомендовала для этой среды название полостной жидкости.
Происходящая при попадании яйца рыб в нерестовую среду спонтанная, т.е. без участия спермия, активация, как правило, не приводит к развитию гаплоидного зародыша, а сопровождается образованием оболочки оплодотворения, аномальной ооплазматической сегрегацией, неправильным дроблением и в дальнейшем — гибелью неоплодотворенных яиц.
Активация яйца сопровождается повышением концентрации свободных ионов кальция в цитоплазме (Gilkey et al., 1978, Lee K.W. et al., 1999). Экзоцитоз кортикальных гранул в яйце рыб, приводящий к образованию оболочки оплодотворения, вероятно, активируется ионами кальция и включает в себя ряд событий, в том числе реорганизацию кортикального слоя актина в яйце (Iva-nenkov et al., 1990, Beсker, Hart, 1999). Было показано, что при спонтанной активации яйца рыб, как и при нормальном оплодотворении, происходит волнообразное повышение концентрации ионов кальция в цитоплазме и экзоцитоз кортикальных гранул (Lee K.W. et al., 1999), однако сигнальные механизмы, вызывающие это повышение, неизвестны. Таким образом, можно предположить, что спонтанная активация как общее явление, характерное для яйца рыб, тесно связана с процессами размножения у рыб и играет важную роль в определении временных параметров процесса оплодотворения.
ОВАРИАЛЬНАЯ ЖИДКОСТЬ РЫБ СОДЕРЖИТ ИНГИБИТОРЫ ПРОТЕАЗ
39
В ряде исследований процесса активации яйца рыб без спермия при инкубации в солевых растворах разного состава (Hart N.H., Yu S.F., 1980, Lee K.W. et al., 1999, Gilkey J.C. et al., 1999) было показано, что некоторые солевые среды замедляют процесс спонтанной активации, однако только овариальная или, по другому, полостная жидкость позволяет длительное время сохранять у яиц рыб способность к оплодотворению (Corley-Smith, G.E. et al., 1995, Минин А.А., Озерова С.Г., 2008а). При этом необязательно брать овариаль-ную жидкость от рыб того же вида, в частности, при работе с яйцами данио используют овариаль-ную жидкость лосося (Corley-Smith, G.E. et al., 1995).
Нами был поставлен вопрос, какие именно компоненты овариальной жидкости предотвращают активацию яйца рыб и каков механизм активирующего действия нерестовой среды. Было обнаружено, что солевые среды, содержащие ингибиторы протеолитических ферментов (проте-аз), предотвращают спонтанную активацию яйца рыб, при этом яйцо сохраняет способность к нормальному оплодотворению (Минин А.А., Озерова С.Г., 2008а). Известно также, что в зрелых фолликулах данио содержатся мРНК и белок ингибитора трипсиновых протеаз серпина типа а1 (Knoll-Gellidda, A. et al., 2006). Мы предположили, что защита полостной жидкостью икры от спонтанной активации обеспечивается ингибиторами протеаз. В настоящей работе был исследован вопрос, содержит ли овариальная жидкость рыб ингибиторы протеаз.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали овариальную (полостную) жидкость трех видов карповых рыб: вьюна (Misgurnus fossilis), карпа (Cyprinus carpió) и данио (Brahidanio rerio).
Икру вьюна получали после стимуляции рыб внутрибрюшинной инъекцией гонадотропного гормона выдавливанием в сухую чашку Петри (Костомарова А.А., Нейфах А.А., 1964), полостную (овариальную) жидкость получали центрифугированием неоплодотворенной икры при 10000 g. Полостную жидкость данио получали центрифугированием неактивированной икры, полученной выдавливанием ее от самок непосредственно перед нерестом после их естественного созревания в присутствии самцов. Полостную жидкость карпа получали из зрелой икры после искусственного созревания самок, вызванного экстрактом гипофиза, на базе ФГУП "ВНИИПРХ", г. Дмитров Московской области благодаря любезной помощи А.В. Рекубратского.
Для изучения способности полостной жидкости ингибировать активность протеаз была использована система определения активности панкреатического трипсина с хромогенным суб-
стратом BAPNA (N-Benzoyl-DL-arginine-4-ni-troanilide). Определяли активность трипсина по изменению во времени оптической плотности при 410 нм. Пробы для определения активности готовили следующим образом: в кювету с буфером А (20 мМ Трис-HCl, pH 7.5; 100 мМ NaCl), содержащую 50 мкл BAPNA (20 мМ в ДМСО) добавляли 1.5 мкг трипсина (исходный раствор 0.15 мг/мл), конечный объем пробы 3 мл.
Для выявления белковых ингибиторов протеаз использовали метод электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДДС натрия) в градиентном полиакриламидном геле (ПААГ) концентрацией 5—15% в сочетании с последующим переносом на нитроцеллюлозную мембрану. Для выявления полос белков, потенциально обладающих активностью ингибиторов протеаз, использовали метод окраски полученного блота биотинилированным трипсином. Окрашивание блотов биотинилированным трипсином (БТ) с дальнейшим окрашиванием с использованием авидина, конъюгированного с пероксидазой хрена, проводили описанным ранее методом (Melrose J. et al., 1994) с диаминобензидином в качестве субстрата пероксидазы. Для биотинилирова-ния панкреатического трипсина крупного рогатого скота использовали сукцинимидный эфир 6-((6-((биотиноил)амино)гексаноил)амино)-гексановой кислоты, биотинилирование проводили по методу, описанному ранее (Melrose J. et al., 1994) с некоторыми модификациями. Очистку БТ проводили с помощью гель-фильтрации на колонке 1 х 100 см с Сефадексом G-50 superfine (Pharmacia) в буферном растворе 0.2 М глицина рН 2.5.
Для предотвращения инактивации белковых ингибиторов протеаз пробы полостной жидкости для электрофореза обрабатывали буферным раствором для приготовления образцов, не содержащим меркаптоэтанола, при комнатной температуре.
Полосы белков, выявленных на блоте окраской БТ, совмещали с полосами на геле после окрашивания Кумасси и вырезали из геля для идентификации белков с помощью масс-спек-трометрии. Идентификацию белков по масс-спектрам протеолитических фрагментов после гидролиза трипсином проводили на базе Отдела протеомных исследований и масс-спектрометрии и Центра постгеномных технологий ФГБУ "ИБМХ" РАМН.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Исследование ингибирующей трипсин активности полостной жидкости вьюна. Для изучения способности полостной жидкости ингибировать активность протеаз была использована система определения активности панкреатического трипсина крупного рогатого скота с хромогенным субстратом BAPNA (N-Benzoyl-DL-arginine-4-ni-
40
МИНИН, ОЗЕРОВА
A
V, мкл
Рис. 1. Ингибирование активности бычьего панкреатического трипсина полостной жидкостью вьюна. Зависимость активности трипсина (усл. ед.) от объема (мкл) добавленной в пробу для определения активности полостной жидкости. Состав проб — см. раздел Материалы и методы.
troanilide). Относительную активность трипсина определяли, измеряя количество образующегося продукта по изменению оптической плотности при 410 нм. Для определения ингибирующей протеазу активности полостной жидкости вьюна измеряли в ее присутствии активность трипсина при разных концентраций полостной жидкости в пробе. Для этого раствор трипсина инкубировали при комнатной температуре в течение 10 минут в оптической кювете с разными объемами полостной жидкости вьюна (20—100 мкл), содержащей 8.8 мг общего белка в буфере А в конечном объеме 1 мл. Затем добавляли туда остальные компоненты до нужного состава и объема 3 мл, после чего регистрировали оптическую плотность каждые 30 c в течение 10 минут.
Результаты определения активности трипсина в присутствии полостной жидкос
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.