БИООРГАНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ, 1995, том 21, № 9, с. 684 - 690
УДК 577.112.6.057:542.95
и-СУЛЬФОТЕТРАФТОРФЕНИЛОВЫЕ ГИДРОФИЛЬНЫЕ АКТИВИРОВАННЫЕ ЭФИРЫ АМИНОКИСЛОТ В ПЕПТИДНОМ СИНТЕЗЕ
© 1995 г. В. Н. Медведкин#, В. Ф. Заболотских*, Е. А. Пермяков**, Ю. В. Митин, М. Н. Сорокина*, Л. В. Клименко
Институт белка РАН, 142292, Пущине Московской обл.; * Пермский филиал ГНЦ "Прикладная химия", Пермь; ** Институт биологического приборостроения РАН, Пущино Московской обл. Поступила в редакцию 4.11.94 г. После доработки 25.04.95 г.
Высокореакционноспособные гидрофильные ("водорастворимые") п-сульфотетрафторфениловые эфиры (ТГБ-эфиры) предложены для пептидного синтеза в водной и водно-органической среде, а также для полусиптеза белков и пептидов в водной среде. Указанные эфиры могут служить основой для создания серии реагентов для химической модификации белков. Являясь аналогами прекрасно зарекомендовавших себя пентафторфениловых эфиров, Tfs-эфиpы обладают высокой реакционной способностью в сочетании с хорошей стабильностью при хранении. Показано, что выражение для скорости реакции (для субстратов А А[ и АА2) имеет вид: v= ¿[Вос-АА^ТГвНН-ААг-ЖЩ0,5 как для воды, так и для ОМБ, т.е. реакция не является обычной реакцией второго порядка. При этом скорость реакции и воде лишь ненамного ниже, чем в ОМИ.
Ключевые слова: пептидный синтез, гидрофильные активированные эфиры, п-сульфотетра-фторфениловые эфиры, кинетика и порядок реакции.
Изучение процесса образования пептидной связи в воде - одна из фундаментальных задач современной биоорганической химии. Осуществление реакции пептидного синтеза в водной среде всегда сопровождается гидролизом активированного эфира аминокислоты, снижающим выход целевого продукта конденсации. Однако эта реакция конкурентно предотвращает еще более нежелательные побочные процессы О- и 8-ацилирования в случае незащищенных боковых функций аминокислот, переэтерификации с карбоксила на карбоксил и некоторые другие. Изучению побочных реакций пептидного синтеза в водной среде посвящена, например, работа [1]. Важным фактором в пользу исследований положительных и отрицательных моментов пептидного синтеза в водной или водно-органической среде является перспектива его промышленного использования благодаря экологической безопасности технологии: водорастворимость компонентов делает возможным применение высокоэффективных установок обратного осмоса для очистки технологических сбросов.
Сокращения: Ршос - 9-флуоренилметилоксикарбонил, -пентафторфенил, Тй; - гс-хлортетрафторфенил; ТГр -2,3,5,6-тетрафторфенил; ТГв - п-сульфотетрафторфенил, №-соль; Ш - 2,3,5-трифторфенил; №р - 2-нитро-4-суль-фофенил.
# Автор для переписки.
Тактика минимальной защиты, необходимая для синтеза в водных средах, впервые реализованная Хиршманом [2], не получила развития, в частности, из-за отсутствия эффективного и стабильного гидрофильного активированного производного аминокислот. В основном тактика минимальной защиты используется в экспериментах по полусинтезу пептидов и белков [3], где стандартная методология пептидного синтеза адаптирована к работе с объектами, растворимыми только в воде. При этом методики, предлагаемые в монографии Оффорда [3], как правило, более применимы к работе в безводной среде, а добавление воды рассматривается как неизбежный и вынужденный фактор.
Современные методы масс-спектрометрии позволяют однозначно решать проблему определения гидрофильных активированных эфиров и изучать механизм пептидного синтеза в водной среде столь же эффективно, как это делается в классическом пептидном синтезе.
Стремление использовать в качестве водорастворимых эфиров аминокислот гидрофильные аналоги хорошо изученных активированных эфиров является логически понятным шагом. В настоящей работе описываются новые активированные л-сульфотетрафторфениловые С№>) эфиры аминокислот (точнее, их натриевые или калиевые
«-СУЛЬФОТЕТРАФТОРФЕНИЛОВЫЕ ГИДРОФИЛЬНЫЕ ЭФИРЫ
685
соли по сульфогруппе), которые являются гидрофильными аналогами пентафторфениловых эфиров [4]. Tfs-эфиpы наиболее реакционноспо-собны из всех описанных к настоящему времени гидрофильных эфиров и к тому же имеют лучшее соотношение скорости аминолиза к скорости гидролиза по сравнению с малоактивными 2-нитро-4-сульфофениловыми эфирами (Квр-эфиры) [5]. №р-эфиры применялись нами в предшествующих экспериментах [6], которые стали первым примером использования водорастворимых активированных эфиров аминокислот для полусинтеза белкового фрагмента.
По своей реакционной способности в водно-органической среде к Tfs-эфиpaм близки 3-суль-фо-1Я-оксисукцинимидные эфиры [7]. Но при работе с последними следует опасаться известной побочной реакции раскрытия сукцинимидного кольца и включения производного янтарной кислоты в растущую полипептидную цепь [8, 9]. Поэтому мы предложили гидрофильный аналог пентафторфениловых эфиров, содержащий сульфо-группу в «аря-положении фторароматического кольца. Исходный п-сульфотетрафторфенол получали стандартным сульфированием 2,3,5,6-тет-рафторфенола олеумом при повышенной температуре (80 - Ю0°С) аналогично [10]. Детальное описание методики в данной работе не приведено, так как исследование проводилось в заводских условиях, пока не оптимизированных. Сульфотет-рафторфенол легко выделяется в виде мононатриевой соли (хорошо сформированные кристаллы сиреневого цвета) при доведении рН раствора до 3 - 4 раствором 1 М №ОН в полунасыщенпом растворе №С1 и охлаждении до 3 - 5°С. После промывки полученных кристаллов хлороформом и последующей перекристаллизации из спирта с эфиром получают натриевую соль я-сульфотет-рафторфенола в виде длинных бесцветных игл с выходом 60 - 70% из расчета на массу сырой реакционной смеси. Структура препарата и его гомогенность доказана методом 19Р-ЯМР (данные не приведены).
Tfs-эфиpы аминокислот мы получали взаимодействием производного аминокислоты с эквивалентом натриевой соли л-сульфотетрафторфенола в среде ОМР с использованием 1Ч,1Ч'-дициклогек-силкарбодиимида в качестве конденсирующего реагента. Присутствие иона натрия затрудняет проведение элементного анализа. По той же причине неинформативным становится такой параметр, как температура плавления (все производные разлагаются при температуре выше 200°С). Ограниченная растворимость Tfs-эфиpoв в большинстве органических растворителей затрудняет их очистку стандартными методами перекристаллизации. Экстракция неприменима по той же причине. В этой связи основной характеристикой полученных соединений являются данные масс-
спектрометрии в сочетании с индивидуальностью препарата при анализе ТСХ, а наиболее надежным способом препаративной очистки оказалась колоночная хроматография на сефадексе ЬН-20 с использованием в качестве элюента метанола или этанола. Наличие активированной сложно-эфирной связи подтверждено с помощью инфракрасной спектрометрии (интенсивная полоса 1792 см-1)- Выход и свойства некоторых полученных нами Т5$-эфиров приведены в табл. 1.
Одной из возможных областей применения ТГв-эфиров является создание на их основе ряда водорастворимых реагентов для химической модификации белков. В качестве примера в табл. 1 приведен Т£в-эфир ¿/-биотипа. Кроме того, к настоящему времени нами получен ряд других Т5$-эфиров 1Ч-защищенных аминокислот, свойства и применение которых будут описаны в отдельных публикациях.
Проведение химического синтеза пептидов в чисто водной среде с использованием Т£8-эфиров возможно, но не всегда целесообразно. Несмотря на высокую гидрофильность, не все Tfs-эфиpы одинаково хорошо растворимы в воде (как и любые другие "водорастворимые" эфиры). Для проведения реакции активированное производное аминокислоты лучше добавлять в виде раствора в органическом растворителе. Это позволяет исключить частичный гидролиз активированного эфира до начала реакции. В наших экспериментах активированные эфиры использовались, как правило, в виде раствора в ОМР или метаноле и добавлялись к раствору нуклеофила в воде или в смеси ЭМР-вода (в зависимости от растворимости нуклеофила).
Синтез дипептидов является хорошей моделью для изучения водорастворимых эфиров, так как аминокислоты, используемые в качестве нуклео-филов, плохо растворимы в органических растворителях. В качестве нуклеофила был выбран ала-нин, а также пролин, для которого плохая реакционная способность в водной среде известна из литературы [5]. Выбор ТГв-эфиров конкретных производных аминокислот обусловлен прежде всего различием в их растворимости. Гидрофильность ТГз-эфиров высока, но все же ее недостаточно,
Таблица 1. Свойства некоторых Т15-эфиров
Активированный эфир Выход, % */ [о] 0° (с 1, метанол) * кг
Вос-А1а-ОТГБ 86 0.18(1) -24 416
Ртос-ЬувфосМШв 90 0.31(1) -13 695
¿/-ВЮППО'ПЙ 82 0.1(1) +23 471
* Масса отрицательно заряженного иона.
чтобы обеспечить хорошую растворимость в воде ряда Ртос-защищенных аминокислот. Ртос-Ьукфос^СЛЪ является одним из таких плохо растворимых в воде соединений. Однако даже для него удается подобрать условия, когда взаимодействующие компоненты находятся в гомогенной фазе. Это оказалось практически недостижимым при использовании в данной реакции гидрофобных Р1'р-эфиров. Реакцию приходится вести в гетерофазной среде, и это отражается как на выходе целевого пептида, так и на времени реакции. Свойства пептидов, синтезированных с использованием Т18-эфиров, приведены в табл. 2.
Существенное место при изучении ТГв-эфиров уделено нами сравнительным кинетическим ис-со.допяниям с целью получения информации по двум интересующим нас вопросам. Первый касается относительной эффективности новых активированных эфиров, а именно: насколько различаются скорости образования пептидной связи и гидролиза активированного эфира? Второй вопрос связан с выяснением разницы в скоростях одной и той же реакции, осуществленной в воде и ОМР. Поэтому кинетические исследования проводились в двух направлениях. Сначала мы сравнили Т1з-эфиры по их реакционной способности и соотношению скорости аминолиза к скорости гидролиза с использованными нами ранее 2-нитро-4-сульфофениловыми (№р) эфирами [11]. Эту группу экспериментов про
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.