научная статья по теме P28GANK – НОВЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЖЕЛУДКА Биология

Текст научной статьи на тему «P28GANK – НОВЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЖЕЛУДКА»

МОЛЕКУЛЯРНАЯ ^^^^^^^^^^^^^^ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ

УДК 577.218;57.085.2;616-006.6

P28GANK - НОВЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ МИШЕНЬ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА ЖЕЛУДКА#

© 2014 г. J.-Y. Zheng*, H. Hu*, J.-J. Du, X.-H. Li*, Q.-C. Zhao*

1State Key Laboratory of Cancer Biology & Xijing Hospital of Digestive Diseases; the Fourth Military Medical University,

17 Changle Western Road, Xi'an, 710032, China Поступила в редакцию 26.04.2013 г. Принята к печати 13.05.2013 г.

Регуляторный белковый комплекс 26S протеасомы человека, p28/PSMD10, играет ключевую роль в развитии раковых опухолей. В представленной работе выясняли клиническую значимость одного их компонентов этого комплекса, белка ганкирина, или p28GANK, как возможного прогностического маркера развития рака желудка. Пользуясь технологией ОТ-ПЦР в реальном времени, мы оценили уровень экспрессии p28GANK у 124 больных раком желудка на парных образцах тканей — опухолевой и нормальной, а также в иммортализированных клетках желудочного эпителия GES-1 и пяти клеточных линиях рака желудка человека. Влияние экспрессии p28GANK на рост клеток определяли методом MTT. Уровень экспрессии p28GANK был выше в ткани рака желудка, чем в соответствующей ей непораженной ткани (p = 0.0033). У больных с высокой экспрессиейp28GANKвыживаемость была ниже, чем у пациентов с низкой экспрессией (p = 0.0037). Из результатов проведенного многомерного анализа следует, что повышенный уровень экспрессии p28GANK служит независимым прогностическим фактором развития рака желудка. Экспрессияp28GANK повышена и в пяти линиях клеток рака желудка. При анализе клеточной пролиферации in vitro показано, что экспрессия белка p28GANK связана с ростом опухоли. На основании полученных результатов p28GANK можно рассматривать как потенциальный прогностический маркер заболевания раком желудка и как новую мишень в терапии этой болезни.

Ключевые слова: p28GANK, рак желудка, прогнозирование, терапевтическая мишень.

P28GANK IS A NOVEL MARKER FOR PROGNOSIS AND THERAPEUTIC TARGET IN GASTRIC CANCER, by J.-Y. Zheng, H. Hu, J.-J. Du, X.-H. Li*, Q.-C. Zhao* (State Key Laboratory of Cancer Biology &Xijing Hospital of Digestive Diseases; the Fourth Military Medical University, 17 Changle Western Road, Xi'an, 710032, China; *E-mail: fmmulxh@yahoo.com.cn). P28/PSMD10, a regulatory complex of the human 26S proteasome, plays a critical role in tumor genesis. This study was designed to clarify the clinical significance of p28GANK in gastric cancer. In order to demonstrate the importance of p28GANK expression for the prognosis of gastric cancer, p28GANK expression in 124 paired cases of gastric cancer and noncancerous regions and immortal gastric epithelial cell GES-1 and 5 human gastric cancer cell lines was analyzed by RT-PCR in real-time. MTT was used to observe the effect of P28GANK on cell growth. P28GANK expression was higher in gastric cancer tissues than in corresponding normal tissues (p = 0.0033), and patients comprising the group with p28GANK high expression had a poorer overall survival rate than those from the low expression group (p = 0.0037). Further, the results of multivariate analysis demonstrated that the high p28GANK expression was an independent prognostic factor of gastric cancer process. P28GANK expression was also up-regulated in five gastric cancer cell lines. As it has been shown by in vitro proliferation assay, p28GANK expression correlated with tumor growth. On the base results of present study one can suggests the p28GANK being useful as a predictive marker for patient prognosis and a novel therapeutic target for gastric cancer.

Keywords: p28GANK, gastric cancer, prognosis, therapeutic target. DOI: 10.7868/S0026898414010182

Рак желудка — одно из наиболее часто диагностируемых злокачественных новообразований и занимает второе место в мире по смертности от

# Текст представлен авторами на английском языке.

^ Авторы внесли одинаковый вклад в выполнение работы.

* Эл. почта: fmmulxh@yahoo.com.cn

различных видов рака. И хотя в мировом масштабе случаи рака желудка в последние годы встречаются реже, смертность от этого вида рака в Китае

99

7*

более высокая, чем смертность от других онкологических заболеваний, причем число летальных исходов составляет 25% от жертв рака желудка во всем мире. Так что поиск генов, ответственных за развитие и прогрессирование рака желудка, очень важен для понимания механизмов онкогенеза этого вида опухолей и для развития его диагностики и планомерного лечения.

Недавно новый онкоген, названный ганки-рин, клонирован в клетки гепатоцеллюлярной карциномы путем вычитательной ДНК-гибридизации [5]. Нуклеотидная последовательность ган-кирина идентична гену p28, белковый продукт которого представляет собой одну из не содержащих аденозинтрифосфатазу субъединиц PA700 — регуляторного комплекса 26S протеасомы человека [6]. В нескольких исследованиях показано, что повышенная экспрессия p28GANK коррелирует с развитием множественной лекарственной устойчивости, ускорением процессов инвазии и метаста-зирования, пролонгированным процессом клеточного деления и подавлением апоптоза [7—11].

Проанализировав экспрессию p28GANK в 124 парах образцов рака желудка и соответствующей непораженной ткани тех же пациентов, а также в иммортализированных клетках желудочного эпителия GES-1 и пяти клеточных линиях рака желудка человека, мы показали важность детекции уровня экспрессии p28GANK для прогнозирования процесса развития рака желудка. Кроме того, нами исследованы изменения клеточной пролиферация in vitro, происходящие при подавлении экспрессии p28GANK. Полученные результаты позволяют предположить, что p28GANK станет новым маркером в прогнозировании течения и лечения рака желудка.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Среды и клеточные линии. Иммортализирован-ные клетки желудочного эпителия GES-1, трансформированные SV-40, а также клеточные линии желудка SGC-7901, MKN-45, MKN-28, BGC-823 и AGS хранились в нашем институте и поддерживались в соответствии с рекомендуемыми нормами. Клеточные линии культивировали в среде DMEM с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки ("Sigma Chemical", США), 100 ед./мл пенициллина и 0.1 мг/мл стрептомицина. Клетки росли при 37°С в инкубаторе с поддержанием влажности и с 5%-ным содержанием CO2.

Трансфекция клеток. Последовательности малых интерферирующих РНК (siRNA) к p28GANK подобраны по методу, описанному ранее [7]. Синтезированные фрагменты обрабатывали рестрик-тазами BaMHI и Hind III и лигировали с линеаризованным вектором pSilencerTM 3.1-H1 Neo ("Ambion", США), в результате чего получали

конструкцию pSi-p28GANK. Последовательности фрагментов вставки проверяли ДНК-секве-нированием. Клетки рассеивали в 6-луночные матрасы и культивировали в среде без антибиотиков. При достижении 90—95% конфлуэнтности клетки промывали дважды фосфатно-солевым буфером (PBS) и добавляли 2 мл DMEM без антибиотиков. Используя в качестве транфектанта Li-pofectamineTM 2000 ("Invitrogen"), 2 мкг siRNA-содержащих плазмид pSi-p28GANK трансфици-ровали в раковые клетки-мишени по протоколу, описанному ранее [8]. Клетки, трансфицирован-ные исходным вектором pSilencerTM3.1-H1 Neo, служили в эксперименте отрицательным контролем. Через 48 ч клеточную среду меняли на ростовую среду с G418 ("Life Technologies") с конечной концентрацией 400 мкг/мл для селекции клонов. Уровень экспрессии p28GANK в G418-резистент-ных клонах оценивали методом вестерн-блот.

Клинические образцы ткани. Сто двадцать четыре пары образцов тканей — рака желудка и нормальной — от каждого пациента с информацией о заболевании получены из Отделения общей га-строинтестинальной хирургии госпиталя Сидзин города Сиань, Китай (Department of General Gastrointestinal Surgery in Xijing hospital, Xi'an, China). Все образцы замораживали в жидком азоте сразу после операции и хранили при -80°С до проведения экстракции РНК. Первичную опухоль желудка у больных, задействованных в исследовании, диагностировали и лечили в госпитале Сидзин в период с 1993 по 2000 г. Истории болезни всех пациентов были подробно описаны. Ни один из них никогда не проходил курсы предоперационной химиотерапии и/или радиотерапии. Все больные перенесли гастрэктомию с удалением лимфоузлов и находились под наблюдением в госпитале Сидзин вплоть до 2005 г. Условия проведения эксперимента были одобрены Комитетом защиты прав людей, являющихся субъектами исследований (the Hospital's Protection of Human Subjects Committee).

Экстракция РНК и ОТ-ПЦР. Тотальную РНК выделяли из замороженных тканей с помощью Recover All Total Nucleic Acid Isolation Kit ("Ambion") в соответствии с рекомендациями производителя. Обратную транскрипцию проводили на образце ткани, содержащем 1 мкг тотальной РНК, используя oligo(dT)18-праймеры и 200 ед. обратной транскриптазы SuperScript II ("Life Technologies"). Полученные кДНК амплифицировали по описанному ранее протоколу [7], используя полимеразу Ex Taq ("TakaRa") и следующие пары праймеров: p28GANK 5'-ATGCTAAGGACCATTATGAGGC-TA-3' и 5'-TCTTGGATGTTTGTGGATGCTTTG-3'; ß-актин 5' - AGCGGGAAATCGTGCGTG- 3' и 5'-CAGGGTACATGGTGGTGCC- 3'. Температурный режим для циклов амплификации: денатурация при 94° С в течение 5 мин и 35 следующих цик-

P28GANK - НОВЫЙ ПРОГНОСТИЧЕСКИЙ МАРКЕР

101

лов: 30 с при 94°С, 30с при 55°С, 30 с при 72°С. В качестве внутреннего контроля использован ген ß-актина. ПЦР-фрагменты разделяли электрофорезом в агарозном геле с бромидом этидия и визуализировали в УФ-диапазоне.

Вестерн-блот анализ. Анализ вестерн-блот проводили, как описано ранее [7], используя следующие антитела: anti-p28GANK ("PharMingen"); anti-ß-actin ("Sigma Chemical") в разведениях 1 : 500 и 1 : 5000 соответственно.

Скорость роста клеточного монослоя. Скорость роста монослоя клеток определяли по методу МТТ, описанному ранее [7], — по скорости превращения водорастворимого 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолиумбромида в нерастворимый формазан в живых клетках. Три тысячи клеток в 200 мл среды рассаживали по 96-луночным матрасам и растили при стандартных условиях. Оптическ

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком