ГЕНЕТИКА, 2012, том 48, № 8, с. 976-982
ГЕНЕТИКА ЖИВОТНЫХ
УДК 575.174.015.3:597.553.2
ПАНЕЛЬ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫХ ЛОКУСОВ ДЛЯ ПОПУЛЯЦИОННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ САХАЛИНСКОГО ТАЙМЕНЯ Parahucho perryi (Brevoort) © 2012 г. М. В. Шитова1, А. А. Юрченко1, Е. Г. Шайхаев1 2, Л. А. Животовский1
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991 e-mail: levazh@gmail.com 2ООО "Лаборатория Изоген", Москва 119333 Поступила в редакцию 28.12.2012 г.
В данной работе показана положительная кросс-видовая (cross-species) амплификация на образцах ДНК сахалинского тайменя некоторых микросателлитных локусов, описанных ранее для других лососевых рыб (Salmonidae). В работе было проанализировано 56 образцов сахалинского тайменя (Parahuchoperryi) из рек Даги, Набиль, Поронай и Агнево (о. Сахалин) по 36 миросателлитным ло-кусам, большая часть которых описана для других видов, но на таймене опробованы впервые. Из локусов, впервые опробованных на таймене (21), два локуса не дали продукта амплификации, а 19 успешно амплифицировались (для некоторых конструировали новые праймеры). Из них 13 ло-кусов оказались мономорфными, а шесть полиморфными и затем использовались в дальнейшем популяционно-генетическом исследовании. В дополнение нами были разработаны новые прайме-ры для уже известных 12 локусов сахалинского тайменя с целью модификации размеров аллелей и оптимизации метода исследования. Еще три локуса были взяты без изменения, что позволило предложить для исследования сахалинского тайменя сводную панель, состоящую из 21 полиморфного микросателлитного маркера, которая опробована на выборках четырех популяций из рек о. Сахалин. Результаты анализа позволяют использовать разработанную панель маркеров для детальных популяционных исследований и оценить уровень генетической дифференциации, инбридинга и миграций у сахалинского тайменя — вида с резко сокращающейся численностью и фрагментиро-ванным ареалом и в дальнейшем выделить базовые популяции с целью охраны этого редкого вида.
Сахалинский таймень, Parahucho perryi (Brevoort) — это узкоареальный, эндемичный вид Дальнего Востока, занесенный в красную книгу России (присвоена категория — 2, сокращающиеся в численности популяции эндемичного для Дальнего Востока вида) [1], а также в красный список МСОП (Международный союз охраны природы; IUCN Red List of Threatened Animals) — как вид, находящийся в критической опасности из-за сокращающейся численности (Critically Endangered). Промышленное и любительское рыболовство, браконьерский вылов, деградация мест обитания и активное хозяйственное освоение существующих сейчас ограниченных территорий обитания сахалинского тайменя (вырубки леса в Приморье и Хабаровском крае, нефтегазовые проекты на острове Сахалин) приводят к снижению численности и фрагментации ареала обитания сахалинского тайменя, что ведет к репродуктивной изоляции особей этого вида [2]. В свою очередь, репродуктивная изоляция у вида с низкой численностью может быть основной причиной генетической дифференциации популяций, что можно выявить, изучая полиморфизм ДНК-маркеров. С помощью этих маркеров можно оценить степень генетической дифференциации вида, уровень инбридинга, миграций и другие попу-
ляционно-статистические данные, которые важны для разработки мер по охране и мониторингу редких видов [3—6].
В популяционных исследованиях для целей охраны и мониторинга редких видов требуется использование большого количества ДНК-маркеров, так как в условиях низкой численности вида очень трудно, а подчас и невозможно, добыть необходимое количество образцов для исследования. Численность особей в некоторых изолированных популяциях сахалинского тайменя обычно не превышает нескольких десятков особей [2]. Таким образом, единственный способ, с помощью которого можно уменьшить статистические ошибки исследования, это использование большого количества ДНК-маркеров. Ранее европейскими и японскими исследователями было предложено два набора микросателлитных локусов для изучения сахалинского тайменя. Один из них включал восемь умеренно полиморфных локусов с динуклеотидными повторами [7], другой — шесть локусов с ди- и тетрануклеотидными повторами [8]. Однако эти два набора не были проанализированы вместе на одних и тех же выборках для оценки совместимости их в популяцион-ном исследовании.
В данной работе к ранее предложенным панелям локусов мы добавили еще шесть дополнительных микросателлитных локусов, обнаруженных у сахалинского тайменя путем межвидовой амплификации (cross-species amplification) и модификации праймеров для некоторых локусов. В итоге мы предлагаем набор из 21 микросателлит-ного локуса, использование которого позволит выявить популяционно-генетическую структуру сахалинского тайменя.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе было проанализировано 56 образцов из четырех популяций сахалинского тайменя о. Сахалин, а именно 31, 11, 11 и 3 образца из рек Даги, Набиль, Поронай и Агнево, соответственно. Все экземпляры были собраны осенью 2009 г. Образцы тканей (кусочки плавника) фиксировали в 96%-ном спирте. Выделение ДНК проводили с помощью наборов Diatom DNA prep 200 фирмы ООО "Лаборатория Изоген" (Россия).
Мы протестировали 36 миросателлитных ло-кусов на указанных выборках тайменя, ряд из которых (21 локус) описан для других видов азиатских лососевых рыб (Salmoninae) и на таймене опробован впервые.
Из 21 локусов, впервые опробованных на таймене, два локуса не дали продукта амплификации, а 19 успешно амплифицировались (для некоторых конструировали новые праймеры), из них 13 оказались мономорфными, а шесть локу-сов полиморфными и использовались в дальнейшем популяционно-генетическом исследовании. В дополнение нами были разработаны новые праймеры для 12 локусов сахалинского тайменя, описанных ранее другими исследователями [7, 8], с целью модификации размеров аллелей и оптимизации метода исследования (табл. 1).
Для проведения ПЦР использовали набор Gen Pack PCR Core ООО "Лаборатория Изоген" (Россия), содержащий ингибированную для "горячего старта" Taq ДНК-полимеразу, дезоксинуклео-зидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед. активности, 200 мкМ и 2.5 мМ, а также оптимизированную буферную систему. Конечная концентрация праймеров в реакции 0.1—0.5 мкМ, количество ДНК 50—100 нг. Конечный объем ПЦР-смеси — 20 мкл. Непосредственно амплификацию осуществляли в термоциклерах "Applied Biosystems 9800 Fast Thermal Cycler" и "Applied Biosystems Veriti 96 Well Fast". Программа амплификации включала в себя следующие стадии: предварительная денатурация 95°C — 5 мин; 8 циклов: денатурация 94°C — 1мин, отжиг 50—60°C — 30 с, элонгация 72°C — 30 с; 25 циклов: плавление 94°C — 30 с, отжиг 50—60°C - 30 с, элонгация 72°C - 15 с.
Температуры отжига праймеров по каждому локу-су указаны в табл. 1.
Фрагментный анализ (за исключением продуктов локусов Ots102, 0ММ1037, OkilO и OtsG68) проводили в вертикальном блоке (длина 21 см) 6%-ного неденатурирующего полиакриламидно-го геля в 0.5х ТВЕ буфере рН 8.0 при 300 В в течение 2—4 ч. Полученные фрагменты визуализировали под УФ-светом в присутствии бромистого этидия (5 мкг/мл). В качестве маркеров длины фрагментов использовали ДНК плазмиды pBr322 (НПО "СибЭнзим", Россия), обработанную ре-стриктазами — либо HaelII, либо HpalI, либо Fsp4HI (НПО "СибЭнзим", Россия). Размеры фрагментов по каждому локусу определяли с использованием программы "Molecular Imaging Software, Version 4.0" фирмы "Kodak".
Для фрагментного анализа аллелей локусов Ots102, OMM1037, Oki10 и OtsG68 использовали прибор для капиллярного электрофореза QIAxcel фирмы QIAGEN. Размеры аллелей определялись с использованием ДНК-фрагментов стандартной длины от 52 пн до 292 пн, с шагом 24 пн, используя программу "BioCalculator Software" (QIAGEN).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Новые маркеры для сахалинского тайменя. 19 из 21 микросателлитного локуса, описанных для других азиатских лососевых рыб (Salmoninae), успешно амплифицировались на образцах сахалинского тайменя. Тринадцать локусов оказались мономорфными, тогда как остальные шесть были полиморфными с числом аллелей от 2 до 17 и генным разнообразием от 0.38 до 0.90 (табл. 1). Среди этих маркеров наиболее вариабельными оказались локусы 0ММ1037 и Ok/10, а наименее вариабельным — локус 0my301 с двумя аллелями и генным разнообразием 0.43.
Микросателлитные локусы с новыми праймера-ми. В данном исследовании мы использовали 15 полиморфных микросателлитных локусов, которые были выявлены у сахалинского тайменя [7, 8]. Для 12 из них мы сконструировали новые праймеры в целях модификации размеров аллелей и оптимизации нашего метода исследования (табл. 1).
Дополнительные маркеры. В дополнение ко всему мы проанализировали еще три локуса с оригинальными праймерами, без каких либо доработок: Hper-5 и Hper-15 [7], и Pper_5 [8].
ОБСУЖДЕНИЕ
Kopun et al. [8] в своей работе сообщают, что по причине сильного филогенетического расхождения сахалинского тайменя и других азиатских лососевых рыб (Salmoninae) единственный способ
978 ШИТОВА и др.
Таблица 1. Характеристика микросателлитных локусов, исследованных на сахалинском таймене
Число аллелей/ожидаемая гетеро-зиготность/ число образцов Размер аллелей (пн) локусов, амплифицированных с
Локус [ссылка] Праймеры (5'—3') Повторяющийся мотив Темпера-тура отжига (Т3), °С новыми прайме-рами оригинальными праймерами (только для полиморфных локусов из работ Hatakeyama et al. [7] и Корип et al. [8])
Новые полиморфные маркеры для сахалинского тайменя
Бтт5 [9] F: agatgtgtgataaactcagcctc Я: agttgtttaaatagggcggatag (СА)„ + + С(СА)т 52 2/0.45/56 ~80—82 —
Бтт17 [9] F: aaggatggtgaggacaataca Я: accttgagaaatctatatgtggtcta (СА)В 52 5/0.38/56 ~132—140 —
Оту 301 [10] Р acttaagactggcaacctt Я: ctacacggccttcgggtgaga Неизвестен 52 2/0.43/56 ~70—72 —
ОММ1037 [11] F: gaacggcgactggatttaatacta Я: ccgctcaccctcgtctcttaaa ^ААА)в 60 17/0.87/46 ~207—263 —
OtsШ [12] F: ggatccaataaggagtgatatagtaga Я: tatcccctttaccatttcccttgctaa ^СТ)в + + ^ССТ)т 60 4/0.67/46 ~256—272 —
ОкШ)
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.