БИОХИМИЯ, 2015, том 80, вып. 8, с. 1224 - 1239
УДК 517.323:615.277.3:577.151.042:577.218
ПАРАЛЛЕЛЬНЫЕ G-КВАДРУПЛЕКСЫ, ОБРАЗОВАННЫЕ ГУАНИН-БОГАТЫМИ МИКРОСАТЕЛЛИТНЫМИ ПОВТОРАМИ, ИНГИБИРУЮТ ЧЕЛОВЕЧЕСКУЮ ТОПОИЗОМЕРАЗУ I*
© 2015 А.М. Оглоблина1, В.А. Банникова2, А.Н. Христич2, Т.С. Орецкая2, М.Г. Якубовская1, Н.Г. Долинная2**
1 Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Институт канцерогенеза, 115478Москва; факс: +7(495)324-1205,
электронная почта: globbi@mail.ru 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, химический факультет, 119991 Москва; факс: +7(495)939-3181, электронная почта: dolinnaya@hotmail.com
Поступила в редакцию 15.12.14 После доработки 16.02.15
В работе методами УФ-спектроскопии и КД определена термодинамическая стабильность и структура G-квадруплексов (G4), образуемых G-богатыми фрагментами микросателлитов человека, которые отличаются числом остатков гуанозина в повторяющейся единице. Показано, что олигонуклеотиды d(GGGT)4 и d(GGT)4 образуют внутримолекулярные параллельные G4, причем температура плавления G-квадруплекса резко уменьшается (более чем на 45°) при переходе от трех- к битетрадным структурам. Повторы d(GT)n не образуют совершенных G4 (одна G-тетрада); элементы такой G-квадруплексной структуры не устойчивы при комнатной температуре и не стабилизируются ионами одновалентных металлов. Для олигонуклеотида d(GGT)4 определена минимальная концентрация ионов К+, способствующая сборке квадруплекса, которая, как оказалось, зависит от поддерживающей концентрации ионов Na+. Впервые показано, что при параллельной ориентации цепей в четырехцепочечной структуре фланкирующие G4-мотив комплементарные участки (в олигонуклеотиде d(CACTGG-CC-(GGGT)4-TA-CCAGTG)) не могут образовать двойную спираль из-за стерической удаленности, а только дестабилизируют G-квадруплекс. Изучено влияние охарактеризованных олигонуклеотидов на активность топоизомеразы I, одного из основных клеточных ферментов, и прослежена взаимосвязь между стабильностью образуемых ими квадруплексов и степенью ингибирова-ния фермента. Наиболее активным ингибитором с IC50 равной 0,08 мкМ оказался олигонуклеотид d(CACTGG-CC-(GGGT)4-TA-CCAGTG), в котором фланкирующие G4-мотив последовательности уменьшали устойчивость сверхпрочной квадруплексной структуры, образованной d(GGGT)4.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: G-квадруплексы, микросателлитные повторы, стабильность и структура G-квадруп-лексов, ингибиторы топоизомеразы I.
Микросателлитные повторы ДНК с размером повторяющейся единицы от 2 до 6 нуклео-тидов широко распространены в геноме эукари-от. Эти некодирующие последовательности ДНК долгое время считали балластными, и лишь в последние два десятилетия появились данные об их особой роли в метаболизме ДНК и функционировании генома. Установлено, что микро-сателлитные повторы являются горячими точками гомологичной рекомбинации и участками
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers in Press, BM 14-341, 05.04.2015.
** Адресат для корреспонденции.
повышенной геномной нестабильности [1]. Эти процессы играют важную роль в многостадийном канцерогенезе и других патологических состояниях [2]. Одной из причин необычных свойств микросателлитных ДНК может служить образование ими неканонических конформа-ций. Унифицированная повторяющаяся последовательность, отличная от случайной, способна генерировать новый структурный мотив из-за синхронизованных локальных изменений вторичной структуры ДНК, определяемой особой геометрией стэкинг-контактов. Действительно, все известные неканонические формы нуклеиновых кислот образуются последовательностями, которые обладают элементами сим-
метрии, повторами и другими отклонениями от случайного распределения нуклеотидных остатков. Объектами нашего исследования служили несколько гуанин-содержащих последовательностей - ё(ОООТ)4, ё(ООТ)4 и ё(ОТ)п, которые имитируют одну из цепей микросателлитных повторов и имеют потенциал образования О-квад-руплексов, одной из наиболее удивительных и активно изучаемых альтернативных форм ДНК [3-5]. О-квадруплексы (О4) образуются путем внутри- или межмолекулярных взаимодействий молекул ДНК или РНК, содержащих тракты олигоО (О-тракты). Кор квадруплекса состоит из двух и более О-тетрад, в которых четыре остатка гуанина из разных трактов соединены системой хугстиновских водородных связей (рис. 1). Стэкинг-взаимодействия плоских О-тетрад формируют специфическую структуру О4. Квадруплексы ДНК и РНК - единственные неканонические структуры, образование которых в живой клетке строго доказано [6-8]. Являясь структурными элементами генома, О-квадруплексы распознаются многими белками и ферментами и влияют на важнейшие биологические процессы, такие как репликация, защита хромосомных концов, транскрипция, трансляция, мутагенез и
рекомбинация ДНК [9-13]. Кроме того, О4 рассматриваются как мишени низкомолекулярных лигандов (потенциальных противоопухолевых средств), влияющих на уровень генной экспрессии [14, 15], а введенные в клетку олигонуклео-тидные квадруплексы (ДНК-аптамеры) сами являются потенциальными лекарственными препаратами [16, 17].
Вероятность образования О-квадруплекса путем перестройки соответствующего участка двуспиральной геномной ДНК (О4-мотива) увеличивается в условиях отрицательной сверхспи-рализации [18]. Одним из основных ферментов, регулирующим топологическое состояние ДНК, является топоизомераза I. С одной стороны, этот фермент способен вызывать релаксацию ДНК, уменьшая количество сверхвитков, а с другой стороны, он может, как было недавно установлено, распознавать некоторые О-квадруп-лексы и связываться с ними, теряя свою ферментативную активность [19]. В частности, показано, что тромбин-связывающий ДНК-аптамер и олигонуклеотиды схожей первичной структуры способны ингибировать активность топоизо-меразы I [20]. Ингибиторы топоизомеразы I представляют собой один из классов современ-
Рис. 1. Схематическое изображение различных по структуре О-квадруплексов. а - Внутримолекулярные О4, различающиеся ориентацией цепей в квадруплексном коре; б - параллельный О4, в котором приведена структура О-тетрад и участки связывания ионов калия (черные кружки); в - типы петель в квадруплексе, которые соединяют О-тракты
ных противоопухолевых препаратов, успешно применяемых при лечении гемобластозов, мелкоклеточном раке легких и ряде других онкологических заболеваний [21].
О-квадруплексы характеризуются огромным структурным многообразием, что обусловлено такими переменными, как количество формирующих квадруплексы молекул (1, 2 или 4), длина О-трактов, взаимная ориентация цепей [22], нуклеотидная последовательность (состав) и длина петель, соединяющих О-тракты [23-25] (рис. 1). Это осложняет понимание закономерностей функционирования О-квадруплексов в геноме и делает необходимым детальное изучение вторичных структур, образуемых конкретными О4-мотивами.
В настоящей работе определена структура и стабильность (в разных экспериментальных условиях) квадруплексных структур, образуемых олигонуклеотидными моделями микросателлитов с тетра-, три- и динуклеотидными повторами - ё(ОООТ)4, ё(ООТ)4 и ё(ОТ)п, которые отличаются числом остатков гуанозина в О-тракте и количеством повторяющихся единиц, а также изучено влияние охарактеризованных олиго-нуклеотидов на активность топоизомеразы I, одного из основных ферментов метаболизма ДНК. Так как в геноме микросателлитные повторы фланкированы нерегулярными последовательностями, в качестве модельных систем мы использовали также олигонуклеотиды, содержащие в себе два мотива - анализируемую повторяющуюся последовательность и фланкирующие ее дуплекс-образующие фрагменты. Для изучения конформационного потенциала исследуемых олигонуклеотидов, оценки термодинамической стабильности образуемых ими вторичных структур и их характеристики использованы методы УФ-спектроскопии и КД. Способность охарактеризованных олигонуклеотидов ингибировать переход плазмидной ДНК в ре-лаксированную форму под действием топоизомеразы I изучена с помощью электрофоретичес-ких методов.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Олигонуклеотиды. В работе использовали очищенные в ПААГ олигодезоксирибонуклео-тиды фирмы «Синтол» (Россия): ё(ОООТ)4 (1), ё(СЛСТОО-СС-(ОООТ)4-ТЛ-ССЛОТО) (2), ё(ООТ)4 (3), ё(ОТ)!5 (4), ё(ОТ>1б (5), ё(ОТ)з1 (6), ё(СЛСТОО-Т-(ОТ)п-Т-ССЛОТО) (7), ё(ОСЛ-СТОО-Т-(ОТ)12-Т-ССЛОТОС) (8), ё(ОСЛСТ-ОО-Т-(ОТ)13-Т-ССЛОТОС) (9), ё(ОСЛСТОО-Т-(ОТ)14-Т-ССЛОТОС) (10), ё(СЛСТОО-Т-
(GT)15-T-CCAGTG) (11), d(GCACTGG-T-(GT)15-T-CCAGTGC) (12), d(GCACTGG-T-(GT)16-T-CCAGTGC) (13), d(GCACTGG-CC-(GT)16-TA-CCAGTGC) (14), d(TAGTCTGGTACTGCAT-GCTATGCACG) (15). Концентрацию олигонук-леотидов определяли спектрофотометрически, используя коэффициенты молярной экстинк-ции, рассчитанные по методу ближайших соседей. Олигонуклеотиды растворяли в буферном растворе А (20 мМ HEPES-KOH, 140 мМ NaCl, 5 мМ KCl, pH 7,3). Полученные растворы помещали в водяную баню, нагретую до температуры 95° и медленно (в течение нескольких часов) охлаждали до комнатной температуры (отжиг).
Для изучения влияния ионов одновалентных металлов на устойчивость вторичной структуры, образованной олигонуклеотидом d(GGT)4, были приготовлены три серии растворов. Пробу 1 первой серии готовили, растворяя d(GGT)4 в буфере Б (10 мМ Tris-HCl, pH 7,2) до конечной концентрации олигонуклеотида 9,4 х 10-6 М в растворе объемом 400 мкл. Эта проба служила контролем, не содержащем ионы калия. Для приготовления других растворов этой серии к пробе 1 добавляли KCl в виде концентрированного раствора или навески в количестве, необходимом для достижения концентрации соли в диапазоне 5—750 мкМ. Вторую серию растворов готовили аналогичным образом в буфере В (10 мМ Tris-HCl, pH 7,2, 20 мМ NaCl). Диапазон концентраций KCl, добавленного к пробам, составлял 4—546 мМ. Для приготовления третьей серии растворов d(GGT)4 в буфере Г (20 мМ HEPES, 120 мМ NaCl, pH 7,3) к пробам добавляли KCl для достижения нужной концентрации в диапазоне 14—307 мМ. В пробах двух последних серий концентрация NaCl была постоянной (20 и 120 мМ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.