РОССИЙСКИЙ ИММУНОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, 2009, ТОМ 3(12), № 1, с. 65-71
= ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ =
ПАРАМЕТРЫ АПОПТОЗА ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ ЛИМФОЦИТОВ И ФАГОЦИТОВ У ЖЕНЩИН В МЕНОПАУЗЕ
© 2009 г. И.А. Васильева, Н.Ю. Сотникова, Е.А. Букина, Ю.С. Анциферова, И.К. Богатова
ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи»
г. Иваново, Россия
Поступила: 27.10.08 г. Принята: 02.02.09 г.
Целью работы было установить у женщин пременопаузального и постменопаузально-го периодов, характер апоптоза лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов периферической крови, оценить экспрессию на их поверхности молекул Fas и FasL, а также содержание сывороточных факторов, регулирующих апоптоз, sFas и p53. Было установлено, что в пре-и постменопаузе наблюдается снижение апоптоза лимфоцитов и моноцитов, угнетение апоптоз индуцирующей функции фагоцитов при высоком уровне экспрессии Fas молекул на поверхности лимфоцитов и повышенном содержании нейтрофилов, находящихся на ранних этапах апоптоза, по сравнению с аналогичными показателями женщин фертильно-го периода. В пременопаузе значительно снижалось сывороточное содержание sFas и р53, тогда как у женщин в постменопаузе уровень sFas не отличался от аналогичного значения фертильных женщин и при этом был достоверно выше, чем в пременопаузе. Содержание р53 в сыворотке крови у женщин в постменопаузальном и пременопаузальном периодах было одинаковым, но сниженным по сравнению с фертильным периодом. Можно предположить, что нарушение апоптоза и его регуляции у женщин пременопаузального и пост-менопаузального периодов может вести к изменению иммунного гомеостаза и развитию заболеваний, ассоциированных с этим периодом жизни женщины.
Ключевые слова: менопауза, апоптоз, sFas, p53
ВВЕДЕНИЕ
Апоптоз является важным биологическим процессом, играющим значительную роль в контролировании численности клеточных популяций и поддержании тканевого гомеоста-за. Около 10 биллионов клеток каждый день погибают путем апоптоза [1], в течении нормальной жизнедеятельности организма или при патологических процессах число погибающих клеток может значительно варьировать, параллельно с увеличением или уменьшением апоптоза. Известно что в центральных органах иммунной системы и периферических тканях, путем апоптоза, элиминируются гиперактивированные и аутоагрессивные иммунные клетки, клетки пораженные патогенами или выполнившие свою функцию и
Адрес: 153003, г. Иваново, ул. Красных Зорь, д. 14, кв. 63. E-mail: niimid.immune@mail.ru
завершившие жизненный цикл [2]. Основная роль апоптозу отводится также в развитии по-стовуляторной атрезии яичников и ремодели-ровании молочных желез [2]. Для нормальной физиологии организма важен строгий контроль над регуляцией процесса апоптоза, поскольку чрезмерное снижение или увеличение числа клеток, подвергающихся апоптозу, может быть причиной различных патологий, включая дефекты развития, аутоиммунные болезни, нейродегенеративные процессы и рак.
Известно о гендерном различии в численности клеток, подвергающихся апоптозу, и в частоте развития аутоиммунных патологий, что подразумевает важную роль половых стероидных гормонов в регуляции процесса апоптоза [3]. Существуют литературные данные, свидетельствующие о прямой зависимости реакций иммунной системы и численности её субпопуляций от фаз овуляторного
цикла у здоровых фертильных женщин [4], что является прямым доказательством влияния половых стероидов на иммунную систему и апоптоз.
После фертильного периода наступает климактерический период — это переходный период в жизни женщины от репродуктивной фазы с регулярными овуляторными циклами к состоянию после прекращения менструации.
Известно, что значительное падение уровня половых стероидных гормонов, возникающее в менопаузе, влияет на гомеостаз всего организма, в том числе и на иммунную систему. С возрастом увеличивается активация клеток иммунной системы, усиливается синтез ИЛ-1 и ИЛ-6 и продукция аутоантител [5], а нарушение апоптоза остеобластов и остеокластов приводит к развитию постменопау-зального остеопороза [6]. Регистрируемое у женщин в постменопаузе изменение численности субпопуляций лимфоцитов и нарушение функции лимфоидных клеток, предполагает участие иммунной системы в развитии возраст-зависимых патологий [7, 8], и может определяться нарушениями регуляции апоп-тоза клеток, участвующих в иммунном ответе [9], однако литературные данные, посвященные данному вопросу крайне малочисленны. В связи с этим целью нашего исследования было оценить параметры апоптоза иммунных клеток у женщин в пременопаузальном и постменопаузальном периодах.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Пациенты
Исследование проводилось на базе ФГУ «Ивановский НИИ материнства и детства имени В.Н. Городкова Росмедтехнологий». В ходе работы были обследованы 35 женщин менопаузального периода, средний возраст которых составил 50,28±0,91 лет (основная группа). Основная группа состояла из 10 женщин пременопаузального периода (средний возраст 45,43±1,09 лет) и 25-ти женщин постменопаузального периода (средний возраст 51,64±0,96 лет). В качестве группы сравнения в исследовании приняли участие 20 здоровых фертильных женщин (средний возраст 33,05±1,85), которые не имели гинекологической патологии, тяжелых соматических и острых инфекционных заболеваний на момент обследования и обратились в консультационно-диагностическую поликли-
нику для консультации по вопросам планирования семьи.
Исследования были одобрены локальным этическим комитетом ФГУ «Ив НИИ МиД им.В.Н. Городкова Росмедтехнологий» и проводились с согласия пациенток.
Процедура выделения периферических лимфоцитов
Материалом для исследования служила периферическая венозная кровь.
Выделение лейкоцитов из периферической крови проводили стандартным методом скоростного центрифугирования в градиенте плотности фиколл-верографина (d = 1,114). Лейкоциты периферической крови собирали в интерфазе среда 199/фиколл-верографин, дважды отмывали средой 199, доводили концентрацию клеток до 1х106 кл/мл и использовали в дальнейшем для проведения цитоме-трических исследований.
Проточная цитометрия
Апоптоз лимфоцитов оценивали в аннекси-новом тесте с одновременным окрашиванием клеток Annexin V и пропидиумом иодидом (PI) (CALTAG Laboratories (USA). Экспрессию Fas и FasL периферическими лимфоцитами, моноцитами и нейтрофилами определяли с помощью набора моноклональных антител: анти-CD95, CD95L, коньюгированных с фикоэритрином (РЕ) (CALTAG Laboratories, USA) в соответствующих гейтах. Процедуру окрашивания и фиксации клеток проводили стандартным способом в соответствии с указаниями фирмы-разработчика. Цитофлюориметрический анализ проводили на проточном цитофлюориме-тре FACScan («Becton Dickinson», USA). Анализ результатов проводили в программе LYSIS 2.
Иммуноферментный анализ
Для исследования сывороточного содержания sFas и p53 кровь в количестве 6 мл отбирали в сухую центрифужную пробирку, оставляли на 10—15 мин до полного свертывания, сгусток крови осторожно обводили по стенке пробирки длинной иглой и центрифугировали при 1500 об/мин 10 мин. Отделившуюся от сгустка сыворотку аликвотами по 200 мкл разливали в пробирки типа Эппендорф и хранили до проведения исследования в холодильнике при —20 С. При необходимости сыворотки хранили при —80 С.
Содержание sFas (Bender MedSystems, Austria) и p53 (Bender MedSystems, Austria) в сыворотке периферической венозной крови определяли методом ELISA на микропланшетном ридере Multiscan EX Labsystems (Финляндия).
Статистический анализ данных
Статистическую обработку данных проводили с расчетом среднего арифметического и ошибки среднего арифметического. Достоверность различий между аналогичными показателями в исследуемых группах определяли по t-критерию Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Параметры аннексинового теста клеток иммунной системы периферической крови в менопаузальном периоде
При анализе полученных данных было выявлено, что в основной группе (у женщин пре- и постменопаузального периодов), общее количество лимфоцитов, вступивших в апоптоз (табл. 1), оцениваемое нами по уровню Annexin V-позитивных клеток, было достоверно выше аналогичного показателя здоровых фертильных женщин (p < 0,001). Дифференцированный анализ содержания лимфоцитов, находящихся на ранних и поздних стадиях апоптоза, показал, что в менопаузальном периоде, уровень Annexin V + /PI — клеток, находящихся на обратимой стадии апоптоза повышался, а содержание Annexin V + /PI+ лимфоцитов не менялось по сравнению с таковым у женщин фертильного периода (p > 0,05).
При исследовании параметров аннекси-нового теста моноцитов у женщин менопау-зального периода (табл. 2) было выявлено достоверное снижение содержания Annexin V-позитивных клеток, преимущественно за счет ранних этапов апоптоза (AnnexinV + PI-) (p < 0,01 в обоих случаях), относительное содержание моноцитов находящихся на поздних этапах апоптоза, по сравнению с фер-тильным периодом, не изменялось (р > 0,05).
Мы также оценивали параметры апоптоза нейтрофилов периферической крови у женщин менопаузального периода (табл. 3). Как видно из представленных данных содержание общего количества нейтрофилов, вступивших в апоптоз в менопаузальном периоде, было сопоставимо по значению с таковым у
Таблица 1. Характеристика апоптоза лимфоцитов периферической крови у женщин менопаузального периода
Параметр, (%) Фертильный возраст (n = 20) Менопауза (n = 35)
Annexin V + 20,00±1,02 15,15±0,76***
Annexin V + / PI- 18,31±0,99 13,52±0,70***
Annexin V + / PI + 1,60±0,20 1,63±0,27
CD95 + 17,33±1,01 29,60±1,13***
CD95L + 7,18±0,45 7,03±0,45
Примечание: В скобках дано число проведенных исследований.
*Различия статистически достоверны по сравнению с показателями здоровых женщин фертильного возраста (*р < 0,05; **р < 0,01; ***р < 0,001).
Таблица 2. Характеристика апоптоза моноцитов периферической крови у женщин менопаузального периода
Параметр, (%) Фертильный возраст (n = 20) Менопауза (n = 35)
Annexin V + 44,10±2,63 35,21±2,12**
Annexin V + / 37,11±2,3 28,59±1,80**
PI-
Annexin V + / 7,01±1,02 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.