ОКЕАНОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 233-240
МОРСКАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 551.465
ПАРАМЕТРЫ ЭКСТРАПАЛЛИАЛЬНОЙ ЖИДКОСТИ ДВУСТВОРЧАТЫХ МОЛЛЮСКОВ - НЕСПЕЦИФИЧЕСКИЕ БИОМАРКЕРЫ КРАТКОВРЕМЕННОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ ВОДНОЙ
СРЕДЫ
© 2007 г. Г. А. Колшчкина1, А. Д. Исмаилов2
1 Институт океанологии им. П.П. Ширшова РАН, Москва 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет Поступила в редакцию 13.09.2006 г., после доработки 02.10.2006 г.
Произведено исследование концентрации гемоцитов, содержания в них АТФ и гистологических особенностей двустворчатых моллюсков при экспериментальном импульсном воздействии дизельного топлива и хлорида кадмия, в том числе в течение трех недель после перемещения животных в чистую воду. Для постановки эксперимента были использованы три вида черноморских двустворчатых моллюсков Anadara inaequivalvis, Mytilus galloprovincialis и Chamelea gallina, собранных в Черном море в ходе 79-го рейса НИС "Акванавт" в мае 2005. Выполненные эксперименты позволяют сделать вывод о том, что воздействие хлорида кадмия в концентрации 2 мг/л и дизельного топлива в концентрации 2 мл/л на протяжении 36 часов вызывает индукцию биохимических и цитологических антистрессовых механизмов в организме моллюсков. Эффект от такого воздействия сохраняется на протяжении трех недель. Исследованные параметры гемолимфы анадары, содержание и процентное отношение эритроцитов, концентрация АТФ в гемоцитах могут быть использованы в качестве биомаркеров неспецифического загрязнения окружающей среды. Для использования параметров гемолимфы мидий и хамелеи для биотестирования необходимы дополнительные исследования.
ВВЕДЕНИЕ
Методы изучения загрязнения водной среды с использованием двустворчатых моллюсков (Вь уаЫа) в настоящее время получили широкое распространение. Способность к аккумуляции загрязняющих веществ в тканях и наличие простой зависимости между их количеством в среде и в организме сделало двустворчатых моллюсков удобными объектами для индикации хронического загрязнения водоемов [13]. Но вопрос о чувствительности моллюсков к импульсным выбросам загрязняющих веществ (кратковременное воздействие больших концентраций) до сих пор не решен. Отмечается, что двустворчатые моллюски требовательны к качеству воды, но отличаются относительной устойчивостью к нефтяному загрязнению, а также замедленной ответной реакцией на воздействие загрязняющих веществ [1, 2, 3].
Стандартные методы экологического мониторинга, анализ содержания загрязнителей в среде и организмах, анализ численности и биомассы членов сообщества, не всегда позволяет детектировать кратковременные изменения условий среды спустя промежуток времени после прекращения действия фактора. Так, в Черном море на фоне перестроек в сообществе макрозообентоса в результате инвазии аллохтонных видов не представляется возможным выделить вклад залпового загряз-
нения водной среды химическими веществами в общую дестабилизацию экосистемы [10].
В связи с этим представляет большой интерес поиск дополнительных подходов к анализу вклада импульсных выбросов загрязняющих веществ в дестабилизацию донной экосистемы. Один из них -исследование физиологического состояния двустворчатых моллюсков, и поиск биомаркеров неспецифического стресса, который может возникнуть в результате химического загрязнения окружающей среды или под воздействием абиотических факторов - резкое снижение температуры, солености. Стрессовое состояние может приводить к аномалиям в развитии молодых особей и повышенной смертности личинок, таким образом, вызывая структурные изменения в сообществе [21].
Существует множество способов исследования физиологического состояния двустворчатых моллюсков, однако сопротивляемость организма двустворчатого моллюска стрессу во многом определяется свойствами его гемолимфы. Клетки гемолимфы, гемоциты, выполняют многие защитные функции (фагоцитоз чужеродных частиц, выделение различных бактерицидных факторов), участвуют в воспалительных реакциях [4, 11], а также принимают участие в пищеварении, экскреции и восстановлении раковины [4, 18]. Последняя функция выполняется гемоцитами экстрапалли-альной жидкости. Это часть гемолимфы, находя-
°c. ш.
45.5
45.0
44.5
44.0
43.5
^ Анапа ^ ^ 200 " Новороссийск
ж ~~ Туапсе
ст. 2157^Х V4.
- Черное море \Ч \Л
Адлер \ 1
- i i i i 1 1 1 1 i N г ~ ^ -
36.0 36.5 37.0 37.5 38.0
38.5
39.0
39.5
40.0
40.5 °в. д.
Рис. 1. Места отбора моллюсков в мае 2005 г. 1 - п. Джемете; 2 - Голубая (Рыбачья) бухта; 3 - станция Шепси.
щаяся в экстрапаллиальном пространстве (между мантией и раковиной). Содержание гемоцитов в экстрапаллиальной жидкости, их свойства и клеточный состав практически не отличаются от клеток гемолимфы в других отделах организма моллюсков [5]. А ее расположение в организме делает ее доступным источником гемолимфы для лабораторных исследований без причинения значительного вреда моллюскам. Таким образом, изменение в составе и свойствах гемоцитов из экстрапаллиальной жидкости может оказаться чувствительным биомаркером загрязнения.
Объектами наших исследований стали двустворчатые моллюски Mytilus galloprovincialis (Bi-valvia, Mytilidae), Chamelea gallina (Bivalvia, Ven-eridae) и Anadara inaequivalvis (Bivalvia, Arcidae), доминирующие в макрозообентосных сообществах Северокавказского побережья Черного моря. Физиологические особенности этих моллюсков в условиях кратковременного антропогенного воздействия были исследованы рядом авторов. При стрессовых воздействиях на Chamelea gallina, вызванных применением различных коммерческих способов ловли рыбы (тралений, драгирований дна) наблюдаются снижение фагоцитарной активности и концентрации гемоцитов, а также снижение активности в них кислой фосфатазы, которые являются показателем иммунного статуса моллюсков [6]. У мидий (Mytilus edulis), поме-
щенных на 24 часа в район с высокой степенью загрязненности промышленными отходами, при гистологическом исследовании наблюдалось увеличение количества гранулоцитов в соединительной ткани вокруг гонад по сравнению с контрольными особями [21].
Таким образом, различные параметры гемолимфы двустворчатых моллюсков могут служить биомаркерами стрессовых воздействий. Но вопрос о том, как долго сохраняются биомаркеры в организме моллюсков, остается нерешенным. Цель нашей работы - комплексное исследование параметров гемолимфы трех видов двустворчатых моллюсков при экспериментальном импульсном воздействии дизельного топлива и хлорида кадмия, в том числе в течение 3-х недель после перемещения животных в чистую воду.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объекты исследования. Моллюски для экспериментальных исследований были собраны в ходе 79-го рейса НИС "Акванавт" в мае 2005 г. водолазным методом. Особи Anadara inaequivalvis размером 40-45 мм были собраны в районе ст. Шепси (рис. 1, 3); Mytilus galloprovincialis размером 30-35 мм - в Голубой (Рыбачьей) бухте (рис. 1, 2); Chamelea gallina размером 10-15 мм - в районе Джемете (рис. 1, 1).
ПАРАМЕТРЫ ЭКСТРАПАЛЛИАЛЬНОИ ЖИДКОСТИ 235
60000
50000
40000
4 30000
м и л о м е г
л к м
20000
10000
(а)
я я
о т
и ц
о м е г
ц
а р
т н
е ц
н
о
«
10000
8000
6000
4000
2000
ы ф
м и л о м е г
л к
100 200 300 400 500 600 Время, часы
(в)
100 200 300 400 500 600 Время, часы
2200 2000 1800 1600 1400 1200 1000 800 600
я я
о т
и ц
i 60000 ге
3 50000
ац
& 40000
ен
Í 30000
о
20000
10000
(б)
100 200 300 400 500 600 Время, часы
(г)
J
100 200
300 400 500 Время, часы
Рис. 2. Концентрация гемоцитов в экстрапаллиальной жидкости моллюсков при экспериментальном воздействии дизельного топлива (обозначено черным цветом) и хлорида кадмия (обозначено серым цветом): (а) -Anadara inaequivalvis (N = 10 моллюсков на точку); (б) - Chamelea gallina (N = 10 моллюсков на точку); (в) - Mytilus galloprovincialis (N = 10 моллюсков на точку); (г) - соотношение клеточных типов у Anadara inaequivalvis.
На основании проведенного предварительного исследования смертности моллюсков и литературных данных (для кадмия ЬС96 = 2.94 мг/л; [9] или 3.5 мг/л [15]) мы выбрали сублетальные концентрации дизельного топлива (2 мл/л) и хлорида кадмия (2мг/л) и время воздействия 36 часов.
Схема эксперимента. Моллюсков содержали в аквариуме на протяжении одной недели перед экспериментом. Воду заменяли ежедневно, и отбирали ее с пирса на расстоянии 150 метров от берега. Для аэрации использовали воздушный насос. Питание моллюсков не нарушалось, а температурный режим соответствовал температурному режиму на глубине обитания животных.
Затем моллюсков поместили в морскую воду с добавлением дизельного топлива Евро (С-1) с содержанием полициклических ароматических углеводородов 2.47% по массе или хлорида кадмия. Аэрация в присутствии загрязнителей способствовала дополнительному перемешиванию воды и насыщению ее кислородом. Дизельное топливо присутствовало в воде в виде мелких капель (эмульсии), а хлорид кадмия в виде раствора.
Спустя 36 часов моллюсков перенесли в аквариум с чистой морской водой и содержали в условиях максимально приближенных к естественным (с ежедневной заменой воды и аэрацией) на протяжении трех недель. Перед началом эксперимента, непосредственно перед переносом в чистую воду и спустя 7, 14 и 21 суток после начала эксперимента мы провели исследование параметров гемолимфы моллюсков и содержания тяжелых металлов (Cd, Ni, Pb, Cu, Cr) и мышьяка в их мягких тканях.
Сравнение свойств гемолимфы из синуса мускула-замыкателя и экстрапаллиального пространства Anadara inaequivalvis. У двадцати контрольных моллюсков, проживших 6 месяцев в аквариуме с искусственной морской водой (Marine Invironment, 18 %о) произвели отбор гемолимфы из экстрапаллиального пространства и из синуса мускула-замыкателя. Для анализа свойств гемолимфы использовали те же методические подходы, которые применяли в основном эксперименте (кроме гистологического исследования).
0
0
0
0
0
0
Концентрация АТР, моль/кл
1.4e - 15
1.2e - 15
1.0e - 15
8.0e - 16
6.0e - 16
4.0e - 16
2.0e - 16
0
i
0 100 200 300 400 500 600 Время,часы
Рис. 3. Кон
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.