УСПЕХИ СОВРЕМЕННОЙ БИОЛОГИИ, 2008, том 128, № 3, с. 245-251
УДК 579.869.1:576.893.1
ПАТОГЕННЫЕ ЛИСТЕРНИ И ПОЧВЕННЫЕ ПРОСТЕЙШИЕ: СОПРЯЖЕННОСТЬ ЖИЗНЕННЫХ ЦИКЛОВ
© 2008 г. В. И. Пушкарева, С. А. Ермолаева, В. Ю. Литвин
Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Рассмотрена проблема паразитизма патогенных листерий в почвенных простейших и связи в разных фазах их жизненных циклов. Экспериментально показано устойчивое существование Listeria monocytogenes высоковирулентного штамма EGD в протозойно-бактериальных ассоциациях и определены экологические условия, при которых формируются покоящиеся формы (цисты) инфузорий Tetrahymena pyriformis и некультивируемые клетки листерий. Сохранение возбудителя листериоза в цистах не приводит к утрате потенциала патогенности. При заражении морских свинок инфицированными цистами покоящиеся клетки листерий, реверсируя в вегетативное состояние, вызывают развитие инфекционного процесса. С общебиологических позиций обсуждается сопряженность и синхронизация жизненных циклов у сочленов паразитарных систем.
Свободноживущие пресноводные простейшие, к которым относятся многочисленные виды ресничных инфузорий - наиболее массовые представители почвенных и водных экосистем. С недавнего времени они привлекли внимание экологов, занимающихся исследованием симбиотических (в том числе паразитических) отношений между одноклеточными эукариотами и возбудителями болезней человека, животных и растений, жизненный цикл которых связан с естественной средой обитания - биоценозами почв и водоемов [13].
Популяции простейших способны к активной жизнедеятельности в вегетативной форме при благоприятных условиях (температура 4-28°С; рН 6.0-8.0; достаточная влажность, наличие питательных веществ), интенсивно размножаясь и достигая высокой численности. Сезонные понижения температуры, высыхание почв и временных водоемов, голодание, техногенные загрязнения среды приводят к инцистированию амеб и инфузорий. Вся жизнь пресноводных и почвенных простейших состоит из циклической смены стадий активной вегетации и покоя [2].
В лабораторных условиях аксеническая культура инфузорий Те1гаИутепа руйЮгшв поддерживается в вегетативной форме на протяжении 3-4 недель (100-140 генераций), после чего начинают появляться немногочисленные цисты [11].
Целенаправленное изучение жизненного цикла пресноводных инфузорий в природных условиях и в экспериментах предпринято лишь недавно [21]. У малоресничных инфузорий рода Ре^ов-ИютЫёшт, составляющих основу планктона альпийских озер Австрии, показана смена циклов от активной вегетации в весенне-летний сезон к тотальному инцистированию в октябре-ноябре. После 4-5 месяцев покоя происходит спонтанное
эксцистирование простейших. Однако впоследствии выяснилось, что на протяжении года остаются малочисленные активные (вегетативные) особи в популяции инфузорий, которые сосуществуют параллельно с основной частью покоящейся популяции. При этом факторы внешней среды (за исключением температуры), запускающие и координирующие механизм массового инцистирования простейших, осенью остаются неизвестными [21]. Высказывается гипотеза о генетической вариабельности популяции, обусловливающей различные варианты ответа на воздействие этих факторов: одни особи сохраняют активность на протяжении зимних месяцев, другие переходят в состояние покоя, т.е. реализуются обе стратегии существования простейших в природной среде обитания.
Эксперименты с природными цистами этих инфузорий в условиях, имитирующих естественные (озерная вода, диапазон температур и освещенности, присутствие водорослей) в стерильной среде, позволили эксцистировать покоящиеся особи в ряде образцов, причем доминирующим фактором, индуцирующим этот процесс, авторы считают повышение температуры от 4 до 18°С [21].
Выявлено воздействие и других абиотических и биотических факторов на эксцистирование Б^отЫёшт сошсит вр. [20]. Присутствие водорослей или их экзометаболитов в среде культивирования, а также высокий уровень аэрации индуцировали процесс перехода популяции из состояния покоя к активной вегетации.
Среди немногочисленных публикаций, касающихся этого направления, не обнаружено, предпринимались ли попытки массового инцистирования популяции ресничных инфузорий в лаборатор-
ных условиях, особенно зараженных патогенными бактериями.
При моделировании протозойно-бактериаль-ной ассоциации нами были выбраны листерии, патогенные для человека и животных. Для Listeria monocytogenes характерна убиквитарность: листерии распространены в различных почвах, богатых гумусом, соленых и пресных водоемах, сточных водах; они регулярно выделяются из гидробионтов, от домашних и диких животных - овец, крупного рогатого скота, свиней, собак, кошек, грызунов и даже из растительных субстратов (силос, сено и т.п.). Существование листерий в широком диапазоне абиотических факторов, многообразные связи с большим кругом низших и высших эукариот свидетельствует о высокой экологической пластичности этих бактерий. Поскольку основным природным резервуаром листерий, как и других возбудителей сапронозов, служат почвы и водоемы [7, 8], межпо-пуляционные взаимоотношения в их биоценозах наиболее значимы для циркуляции и резервации данных микроорганизмов.
Немногочисленные экспериментальные работы по взаимодействию L. monocytogenes, L. seeligeri, L. innocua с простейшими констатировали факт их поглощения амебами Acanthamoeba и ресничными инфузориями Tetrahymena, способность выживать и размножаться в фагосомах, а также длительно сохраняться в цистах простейших [17, 19].
Пушкарева с соавт. [11] провели анализ взаимодействий L. monocytogenes и инфузорий T. pyri-formis на популяционном, клеточном и ультраструктурном уровнях. Оказалось, что высоковирулентные листерии (штамм EGD) способны длительно (более 45 сут) сосуществовать с вегетативными клетками простейших в стерильной почве при их невысокой численности, близкой к естественной - 103 особей на 1 г. Внутриклеточные события развивались по пути незавершенного фагоцитоза, характерного для многих грамот-рицательных бактерий, но впервые описанного для грамположительных листерий [11]. Благоприятный для листерий исход взаимодействия со сво-бодноживущими простейшими обусловлен действием мембранолитических ферментов, порообразую-щего токсина, листериолизина О и фосфолипаз патогенных листерий [5].
Задача данной работы - экспериментальная оценка взаимодействий L. monocytogenes с почвенными инфузориями в разных фазах их жизненного цикла, возможности сохранения листерий в цистах и потенциала их вирулентности для животных.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В экспериментах использованы: вирулентный штамм L. monocytogenes EGDe (получен от J.A. Vazguez-Boland, Univ. Bristol); аксеническая
культура инфузорий T. pyriformis (из коллекции нашей лаборатории) и морские свинки весом 350 г (из питомника РАМН, Столбовая). Листерий культивировали на жидкой и плотной среде BHI (Difco), а при высевах из внутренних органов животных - на селективной среде Palcam. Инфузории выращивали на сердечно-мозговом бульоне при 25 °С в течение 5-7 сут до плотности 106 особей в 1 мл. Простейших, находящихся в вегетативной форме, заражали культурой листерий в экспоненциальной фазе роста с нагрузкой l0o и 1000 микробных клеток на особь.
Концентрацию планктонных бактерий регистрировали путем подсчета числа колониеобразу-ющих единиц (КОЕ/мл) на агаре, а инфузорий -микроскопией в камере Горяева (микроскоп Am-plival, увеличение х20).
Фоторегистрацию ассоциаций в динамике проводили с помощью микроскопа Olympus EX 71 (увеличение х320).
Кератоконъюнктивальную биопробу ставили путем введения инфекционного материала за нижнее веко морских свинок. Реакции фиксировали в динамике (1-5 сут) фотометрией.
Животных заражали перорально, вводя по 1.0 мл цист, инфицированных листериями, а также исходной (контрольной) культурой с помощью специальной пипетки. Забор органов (печени, селезенки) проводили стерильно, после усыпления морских свинок, помещая каждый орган раздельно в изотонический раствор. После раздельной гомогенизации печени и селезенок проводили высевы на селективную среду для количественного учета листерий. Концентрацию листерий в кишечнике учитывали ежедневно при посевах фекалий в последовательных разведениях на селективную среду.
Биохимические свойства изолятов L. monocytogenes из кишечника, печени и селезенки животных оценивали на тест-системах API-Listeria (Bio-Merieux). Индикацию возбудителя осуществляли бактериологически, а при отрицательных посевах -с помощью ПЦР с парой праймеров Lis-1 (5GCATCTGCATTCAATAAAGA), Lis-2(5TGTCA CTGCATCTCCGTGGT), основанных на последовательностях гена листериолизина hly [4].
Статистическую обработку осуществляли по программе Excel 2000 (Microsoft Inc., 1999), Statis-tica for Windows v. 5.0 (Statsoft Inc., 1995).
РЕЗУЛЬТАТЫ
На первом этапе следовало оценить в динамике соотношение вегетативных и покоящихся (цисты) форм простейших при заражении культурой листерий. На рис. 1 видно, что в протозойно-бак-териальной ассоциации при оптимальной для обеих популяций температуре (28°С) количество ве-
□ Цисты □ Вегетативные особи
7 сут КОНТРОЛЬ 30 сут
7 сут ОПЫТ 30 сут
Рис. 1. Стимуляция цистообразования инфузорий под воздействием патогенных листерий.
гетативных клеток инфузорий постепенно снижалось, а цист становилось больше.
Бактериальная популяция при культивировании с простейшими после короткой логарифмической фазы (3 сут) также постепенно снижала численность в последующие 6 сут, после чего устанавливалось динамическое равновесие: темпы гибели и размножения листерий были одинаковы, и до конца наблюдений (30 сут) концентрация листерий составляла 105 КОЕ/мл. Подобная динамика численности характерна для многих патогенных бактерий при взаимодействии с простейшими, так как с первых минут контакта начинается фагоцитоз с постепенной утилизацией части бактерий, однако резистентная к перевариванию часть популяции сохраняет способность к активному размножению [11].
В отсутствие инфузорий (контроль) кривая динамик
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.