БИОФИЗИКА, 2008, том 53, вып.6, с. 1073-1077
БИОФИЗИКА СЛОЖНЫХ СИСТЕМ
УДК 576.3
РЕГИОНАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОПЕРЕЧНОЙ ЖЕСТКОСТИ РАССЛАБЛЕННЫХ И АКТИВИРОВАННЫХ ВОЛОКОН КАМБАЛОВИДНОЙ МЫШЦЫ КРЫСЫ
© 2008 г. И.В. Огнева, Д.В. Лебедев*, В.В. Исаев-Иванов*, Б.С. Шенкман
ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, 123007, Москва, Хорошевское шоссе, 76а;
E-mail: ogneva@imbp.ru, iogneva@yandex.ru *Институт ядерной физики им. Б.П. Константинова РАН, 188300, Гатчина Ленинградской области,
Орлова роща Поступила в редакцию 26.06.08 г.
Методом атомной силовой микроскопии измерена поперечная жесткость глицеринизированных и демембранизированных волокон камбаловидной мышцы крыс линии Wistar в различных функциональных состояниях. Показано, что поперечная жесткость расслабленных волокон в районе Z-диска примерно в два раза выше, чем в районе M-линии. Однако жесткость в проекции Z-диска и М-линии глицеринизированных волокон существенно ниже, чем демембранизированных. В активированном состоянии значения механических параметров достоверно выше, чем в расслабленном. Однако если для глицеринизированных волокон жесткость Z-диска возросла примерно в два раза по сравнению с расслаблением, то для демембранизированных волокон она увеличилась более чем в четыре раза. При этом в районе М-линии жесткость как глицеринизированных, так и демембранизированных волокон увеличилась примерно в три раза.
Ключевые слова: поперечная жесткость, мышечное волокно, цитоскелет, атомно-силовая микроскопия.
По современным представлениям изучение поперечной жесткости мышечных волокон может быть актуально в связи с сигнальной и структурной ролью различных белков, формирующих внесаркомерный цитоскелет (костаме-ры) и связанных с мембраной, в механотранс-дукции. Показано, что мутации в некоторых белках костамера ведут к развитию миопатий и миодистрофий, таких как конечностно-пояс-ная дистрофия типов 2С, 2Б, 2Е, 2Б, связанная с изменением саркогликанового комплекса [1], или миодистрофии Беккера и Дюшенна, ассоциированные с мутацией в гене дистрофина, которая приводит к отсутствию стабильной молекулы дистрофина в клетках и, как результат, к нестабильности сарколеммы и индуцируемому нагрузками некрозу мышечных волокон [2]. Тем не менее для большинства известных заболеваний связь между механическими свойствами мышечных волокон и мутациями в генах, кодирующих различные белки сократительного аппарата и внесаркомерного цитоскелета, до сих пор остается малопонятной.
Большую часть объема мышечного волокна, представляющего собой вытянутую в продольном направлении клеточную структуру, зани-
мает сократительный аппарат, образованный миофибриллами. В целом механические характеристики волокна определяются структурно-функциональным взаимодействием трех его составных частей с принципиально различными механическими свойствами: миофибриллярного аппарата, костамеров и сарколеммы.
В современной литературе имеется относительно небольшое число работ, посвященных исследованию поперечной жесткости как целых мышечных волокон, так и одиночных миофиб-рилл. Большинство результатов получено на интактных мышцах кроликов и мышей различных линий, а также на культурах клеток и частично дифференцированных миобластах. Так, в работе [3] на недифференцированных мышечных клетках мышей показано, что модуль Юнга составляет 11,5 ± 1,3 кПа, а на восьмой день дифференцировки повышается в четыре раза и достигает значения 45,3 ± 4,0 кПа. Авторы работы [4] определили модуль Юнга С2С12 миобластов мышей линии С3Н, равным 24,7 ± 3,5 кПа. Этот же показатель для дифференцированных мышечных волокон мышей линии СБ1 составляет 61 ±5 [5].
Цель нашей работы состояла в измерении поперечной жесткости и модуля Юнга в проекциях Z-диска и М-линии как интактных, так и демембранизированных волокон в расслабленном, активированном кальцием и ригорном состояниях.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В эксперименте использовали семь половозрелых самцов крыс линии Вистар в двухмесячном возрасте, выращенных в питомнике ГНЦ РФ ИМБП РАН. Животных содержали в стандартных условиях. Они получали корм в соответствии с рационом для лабораторных животных и воду ad libitum. Все процедуры с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ ИМБП РАН.
Камбаловидную мышцу вырезали от сухожилия до сухожилия и, с целью частичного разрушения клеточной мембраны, обрабатывали согласно методике химического скинирова-ния, которая описана в работе [6]. До начала проведения экспериментов пробы хранили при температуре -20°C в буфере, содержащем в равных долях по объему расслабляющего раствора R (20 мМ МОРБ, 170 мМ пропионата калия, 2,5 мМ ацетата магния, 5 мМ K2EGTA, 2,5 мМ АТФ) и глицерола.
В день эксперимента пробы переносили в раствор R, в котором выделяли одиночные глицеринизированные мышечные волокна.
Для получения демембранизированных волокон одиночные глицеринизированные мышечные волокна, находящиеся в растворе R, инкубировали с детергентом тритоном X-100, конечная концентрация которого составляла 2% по объему, в течение 12 ч при температуре 4°C. После обработки детергентом полученные демембранизированные волокна отмывали в растворе R.
Для измерения поперечной жесткости выделенные волокна прикрепляли ко дну жидкостной ячейки атомно-силового микроскопа, фиксируя их кончики с помощью специального клея Fluka shel^ ■№ах-1тее (Sigma). В зависимости от серии экспериментов ячейку заполняли либо расслабляющим раствором R, либо активирующим раствором A (20 мМ МОРБ, 172 мМ пропионата калия, 2,38 мМ ацетата магния, 5мМ CaEGTA, 2,5 мМ АТФ). Все эксперименты проводили при температуре 12°C.
Атомно-силовая микроскопия. Измерения поперечной жесткости как глицеринизирован-ных, так и демембранизированных волокон проводили, используя инвертированный микроскоп О1утрш XI, соединенный с атомной си-
ловой головкой БМЕКА™ (НТ-МДТ, Россия). Жесткость для каждого кантилевера корректировалась по положению резонанса.
Для работы в жидкости использовали самые мягкие кантилеверы с коэффициентом жесткости на уровне 0,01 Н/м. Применяли контактный режим как для получения изображения, так и для измерения поперечной жесткости. Радиус гс кривизны кончика всех использованных кан-тилеверов считался равным 10 нм.
Для оценки длины саркомеров и идентификации 2-диска и М-линии использовали АСМ-изображение. Под длиной саркомера понимали расстояние между двумя соседними выпуклостями рельефа, которые принимали за 2-диск.
Для определения глубины продавливания Л8 мягкого волокна использовали две силовые кривые, измеренные: 1) в точке интереса на волокне и 2) на стекле при тех же значениях приложенной силы Максимальная приложенная сила не превышала 5 нН при работе на воздухе и 1 нН при работе в жидкости. При этом значения параметра Л8 могли составлять от нескольких десятков до сотен нанометров.
Поперечную жесткость образца к,,, пкН/нм, находили по формуле:
4 •=ч'
при этом максимальная глубина продавливания составляла 50 нм.
Модуль Юнга образца Е5, кПа, вычисляли, используя решение контактной задачи Герца по формуле:
E =
3FS(1 -
s 4^3/2Г1 /2 '
где ц - коэффициент Пуассона. Считая клетку несжимаемой, этот коэффициент обычно принимают равным 0,5 [3,4,7,8].
Полученные результаты статистически обрабатывали с помощью стандартных методов, реализованных в Мкго^ой Ехсе1. Данные представляли в виде М ± т, где М - среднее значение оцениваемой величины, т - стандартная ошибка среднего значения. Для получения каждого среднего значения использовали минимум 11 измерений.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Структурные особенности поверхности гли-церинизированных и демембранизированных мышечных волокон. Анализ исчерченности гли-
РЕГИОНАЛЬНОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ПОПЕРЕЧНОЙ ЖЕСТКОСТИ 1075
нм
мкм
Рис. 1. АСМ-изображение расслабленного интакт-ного волокна камбаловидной мышцы крысы.
МКМ
Рис. 2. АСМ-изображение расслабленного демем-бранизированного волокна камбаловидной мышцы крысы.
церинизированных мышечных волокон в расслабляющем растворе показал, что в районе 2-линии наблюдается существенное относительно средней линии поверхности утолщение волокна, которое примерно в два раза больше, нежели в районе М-линии, обусловленное, по всей видимости, наличием перпендикулярно ориентированных подмембранных структур ци-тоскелета - костамеров (рис. 1).
Это подтверждается данными, полученными на демембранизированном волокне, где 2- и М-линии практически не отличимы друг от друга по высоте (рис. 2).
Длина саркомера мышечного волокна в расслабленном состоянии, определенная как расстояние между утолщениями, которые соответствуют 2-дискам, составляет 2,48 ± 0,03 мкм. В активированном кальцием состоянии длина саркомера составляет 2,42 ± 0,06 мкм.
Поперечная жесткость и модуль Юнга мышечных волокон. Поперечная жесткость расслабленных глицеринизированных волокон, определенная с помощью силовых кривых, в районе 2-диска примерно в два раза выше, чем в районе М-линии, и составляет 3,18 ± 0,18 пкН/нм (рис. 3). Соответствующий модуль Юнга равен 55 ± 3 кПа для 2-диска и 25 ± 3 кПа - для М-линии.
Полученные значения поперечной жесткости для расслабленных демембранизированных волокон существенно превышают аналогичные показатели для глицеринизированных мышечных волокон, хотя жесткость в районе 2-диска также достоверно выше, чем М-линии. Так, поперечная жесткость 2-диска составляет 6,27 ± 0,20 пкН/нм, а М-линии - 3,84 ± 0,29 пкН/нм.
Значения поперечной жесткости как глице-ринизированных, так и демембранизированных мышечных волокон в активированном состоянии значительно выше, чем в стадии расслаб-
ления. Однако если для глицеринизированных мышечных волокон жесткость Z-диска возросла примерно в два раза по сравнению с расслаблением и составила 7,0 ± 0,4 пкН/нм, то для демембранизированных волокон жесткость Z-диска увеличилась более чем в четыре раза и составила 28,7 ± 1,0 пкН/нм. При этом в районе М-линии жесткость как глицеринизированных, так и демембранизированных волокон увеличилась примерно в три раза и ее значения составили 4,21 ± 0,16 пкН/нм и 12,4 ± 1,2 пкН/нм соответственно.
ОБСУЖДЕНИЕ
При анализе АСМ-изображений б
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.