ш
УДК: 577.114:581.192:574.917:633.88
ПЕКТИНОВЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ КАЛЛУСНОЙ ТКАНИ СТЕБЛЯ РЯБИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ ЗОЯБШ ЛиСиРЛЯ1Л К
© 2014 г. А. А. Злобин*, Е. А. Мартинсон*, С. Г. Литвинец*- #, Р. Г. Оводова**, Ю. С. Оводов**
*Вятский государственный университет, 610000, Киров, ул. Московская, 36
**Институт физиологии Коми научного центра Уральского отделения РАН, 167982, Сыктывкар, ул. Первомайская, 50
Поступила в редакцию 01.08.2013 г. Принята к печати 03.09.2013 г.
Из каллуса стебля рябины выделены фракции полисахаридов $Ас1 и $АсП. Показано, что полисахариды фракции $Ас1 принадлежат к группе арабиногалактана II. Фракция $АсП, называемая сорбаном, представляет собой пектиновые полисахариды — компоненты протопектинового комплекса клеточной стенки каллуса. В составе $АсП найдено высокое содержание остатков галакту-роновой кислоты и набор нейтральных сахаров, характерный для рамногалактуронана I. Состав и свойства $АсП в сочетании с данными метода метилирования позволяют предположить, что основу сорбанов составляют 1,4-а-^-галактопиранозилуроновые остатки, а нейтральные сахара представлены 1,4-связанными остатками глюкопиранозы и ксилопиранозы, 1,5-связанными остатками арабинофуранозы, 1,6-связанными остатками галактопиранозы и маннопиранозы, а также терминальными остатками глюкопиранозы и ксилопиранозы. Показано, что рост каллуса сопровождается практически постоянным содержанием в сорбанах (фракция $АсП) галактуроно-вой кислоты и остатков нейтральных сахаров.
Ключевые слова: пектин, рябина, ГЖХ-МС, Sorbus aucuparia L., каллус, сорбаны.
DOI: 10.7868/S013234231402016X
ВВЕДЕНИЕ
Пектиновые полисахариды обладают широким спектром физиологической активности, которая определяется их структурными характеристиками [1]. В то же время физико-химические свойства этих биополимеров существенно зависят от стадии онтогенеза и условий произрастания растений. В этом отношении культуры изолированных клеток и тканей, которые представлены относительно гомогенными системами из клеток с первичными клеточными стенками, являются удобными моделями для изучения закономерностей биосинтеза фитополисахаридов, а также состава и строения их углеводных цепей. Кроме того, культуры клеток и тканей in vitro имеют ряд преимуществ перед нативными растениями: отсутствие организменного контроля; независимость от климатических условий; возможность оптимизации процесса культивирования и накопления пектинов в клетках.
Сокращения: иА — уроновые кислоты; СМ — степень ме-тилэтерифицирования; ТМС — триметилсилил. #Автор для связи (тел.: +7(962) 898-51-16; факс: +7 (8332) 64-15-91; эл. почта: litvinets@list.ru).
Целью данной работы является химическая характеристика пектиновых полисахаридов кал-лусной ткани стебля рябины обыкновенной Sor-bus aucuparia L., которые, несмотря на широкое применение плодов данного растения в пищевой и фармацевтической промышленности, практически не изучены.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Каллусную ткань стебля рябины обыкновенной культивировали на питательной среде MS, содержащей 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты от 1 до 2 мг/л и 6-бензиламинопурина — от 0.1 до 0.4 мг/л, в течение 14, 21 и 26 сут. Максимальный рост каллуса наблюдался на среде с концентрациями 2,4-дихлорфеноксиуксусной кислоты 1 мг/л и 6-бензиламинопурина — 0.1 мг/л (на 21-е сутки индекс роста ткани составил 0.54 ± 0.01 в сутки). Извлечение водорастворимых полисахаридов из каллусной ткани проводили последовательной экстракцией водой (фракция SAcI) и после гидролиза протопектина — 0.7% раствором оксалата аммония при 68°С (фракция SAcII). Ранее [2], при использовании аналогичной схемы
211
6*
Таблица 1. Состав фракций водорастворимых полисахаридов каллусной ткани стебля рябины обыкновенной
Время культи-вирова-ния, сут Выход, %* Содержание, %
Фракция СМ, % ИА Ага 0а1 КЬа Ху1 Мап 01с Белок
14 8Ас1 2.8 3 8 10.9 40.3 1.7 9.5 Сл. 28.5 Н.о.
8Ас11 1.6 1 66 5.6 5.7 1.0 0.4 Сл. 2.2 10.0
21 8Ас1 2.6 6 9 12.4 42.0 1.5 7.6 Сл. 21.6 Н.о.
8Ас11 2.4 25 66 4.7 4.7 1.9 1.3 0.2 1.7 6.7
26 8Ас1 4.1 3 9 12.4 47.3 Сл. 6.4 Сл. 20.6 Н.о.
8Ас11 2.8 1 66 5.0 6.8 0.4 1.0 Сл. 1.0 7.6
* Выход в пересчете на "сухое" вещество; Сл. — следовые количества; Н.о. — не определяли; иА — уроновые кислоты.
экстракции, из плодов рябины обыкновенной с суммарным выходом 4.2% нами были выделены фракции водорастворимых полисахаридов. Было показано, что они представлены пектиновыми полисахаридами, которые были названы сорба-нами. Характеристика полученных фракций водорастворимых полисахаридов каллуса стебля рябины приведена в табл. 1.
Как следует из данных, приведенных в табл. 1, суммарное количество фракций водорастворимых полисахаридов в каллусной ткани стебля рябины составило от 4.4 до 6.9%. При этом наибольшее содержание фракций растворимых в горячей воде полисахаридов 8Ас1 и сорбанов 8АсП достигается на 26-е сутки культивирования каллусной ткани. Обе фракции (8Ас1 и 8АсП) представлены кислыми полисахаридами. Однако в отличие от фракций полисахаридов 8АсП, входящих в состав протопектина, содержание остатков гликуроно-вых кислот во фракциях 8Ас1 значительно ниже и составляет от 8—9. Среди нейтральных моносахаридов в составе 8Ас1 преобладают остатки галактозы, глюкозы и арабинозы. Достаточно высокое содержание остатков глюкозы свидетельствует о наличии в них глюканов некрахмальной природы (отсутствие образования заметных количеств глюкозы при действии на данные фракции а-амилазы и отрицательная проба с йодом).
Фракции 8 Ас II, выделенные из протопекти-нового комплекса клеточных стенок каллуса, характеризуются высоким содержанием остатков гликуроновых кислот (66%). Методом ГЖХ-масс-спектрометрии ТМС-производных в составе полисахаридов идентифицированы остатки га-лактуроновой кислоты (0а1А), а также в следовых количествах обнаружены остатки глюкуроновой кислоты. Наличие незначительного количества терминальных остатков а-^-глюкопирано-зилуроновой кислоты в боковых цепях рамнога-лактуронана-1 (ЯО-1 ) показано для целого ряда пектиновых полисахаридов [1]. В целом можно отметить, что фракции полисахаридов каллуса
8АсП имеют моносахаридный состав, типичный для пектиновых полисахаридов плодов рябины [2], т.е. представлены сорбанами.
Содержание остатков гликуроновых кислот в 8Ас1, а также количество остатков галактуроно-вой кислоты в составе сорбанов 8АсП протопек-тинового комплекса в процессе культивирования остается приблизительно на одном уровне. При этом степень метилэтерифицирования остатков галактуроновой кислоты в сорбане 8АсП возрастает к 21-м суткам культивирования (25%), а затем снижается до значения СМ сорбанов 14-су-точной культуры (1%).
Максимальное количество нейтральных моносахаридов во фракциях 8Ас1 накапливается на 14-е сутки культивирования. При этом наибольшему изменению содержания подвержены остатки галактозы, арабинозы, ксилозы и глюкозы. Так, на начальных этапах культивирования растворимые полисахариды 8Ас1 отличаются более высоким содержанием остатков глюкозы и ксилозы (28.5 и 9.5% соответственно), а на 26-е сутки культивирования в них возрастает количество остатков арабинозы и галактозы (до 12.4 и 47.3% соответственно). Можно также отметить незначительное снижение количества нейтральных моносахаридов (арабинозы, галактозы, глюкозы, ксилозы и рамнозы) в 8АсП в процессе роста каллусной культуры. Однако изменение состава сорбанов в процессе культивирования каллуса рябины выражено в меньшей степени, чем для фракций полисахаридов 8Ас1.
Для оценки гомогенности фракций растворимых в горячей воде полисахаридов 8Ас1 и сорбанов 8АсП каллусной ткани были использованы методы гель-фильтрации и ионообменной хроматографии. При разделении фракций 8Ас1 и 8АсП на сефакриле 8-500 получены две основные фракции 8АсЬ и 8Ас1Ь, которые составляют более половины от исходных 8Ас1 и 8Ас11. Они имеют константы распределения при гель-хроматографии
ПЕКТИНОВЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ КАЛЛУСНОИ ТКАНИ СТЕБЛЯ РЯБИНЫ
Таблица 2. Состав фракций полисахаридов каллуса стебля рябины после разделения на 8-500
213
Фракция Выход, %* Г I20 [а] в СМ, % Содержание, %
ИА Ага Gal КЬа Ху1 Мап G1c Белок
БАсЬ 57 Н.о. Н.о. 18 20.2 50.3 1.9 3.7 Сл. 5.2 6.4
БАсШ 66 + 104 29 70 5.5 4.2 0.6 0.6 Сл. 0.5 3.0
Примечания. * % от количества материала нанесенного на колонку; Н.о., Сл. — см. примечания к табл. 1.
Таблица 3. Состав фракций полисахаридов после разделения сорбанов каллуса стебля рябины на DEAE-целлю-лозе
Фракция Выход, %* 20 [аЬ СМ, % Содержание, %
Ga1А Ага Ga1 КЬа Ху1 Мап G1c Белок
БАсП-Ы 26 +128 Н.о. 75 3.4 1.0 0.2 Сл. Сл. Сл. 6.1
БАсП-2ё 24 +226 14 77 1.0 0.6 0.4 0.2 Сл. Сл. 5.8
Сокращения см. в примечаниях к табл. 1 и 2.
равные 0.10 и 0.14 соответственно, т.е. образованы высокомолекулярными полисахаридами (табл. 2).
Фракция БАсЬ представлена кислыми полисахаридами с содержанием остатков гликуроновых кислот 18% из которых в виде ТМС-производных идентифицированы только остатки глюкуроно-вой кислоты. Преобладающими нейтральными моносахаридными остатками в ней являются остатки галактозы и арабинозы. Все это свидетельствует о том, что данная фракция представлена арабиногалактаном-11 [3], который может использоваться в клетках каллуса для построения боковых углеводных цепей сорбанов. В отличие от исходных полисахаридов БАс1 во фракции БАсЬ содержится значительно меньше остатков глюкозы, т.е. в результате гель-фильтрации из ее состава, вероятно, были удалены низкомолекулярные глюканы.
Очищенный с помощью гель-фильтрации сор-бан БАсШ характеризуется более высоким содержанием остатков галактуроновой кислоты (в составе данной фракции в следовых количествах также идентифицированы остатки глюкуроновой кислоты) со степенью метилэтерифицирования равной данному показателю для исходного сорба-на каллуса БА1Ь. Его водные растворы имеют высокие положительные значения углов удельного вращения, характерные для 1,4-а-^-галактуро-нанов. В отличие от сорбанов плодов [2] они содержат меньшее количество остатков арабинозы, галактозы и рамнозы. Скорее всего, в состав БАсШ входит низкометилэтерифицирова
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.