ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2011, том 47, № 1, с. 90-94
УДК 581.143:577.114
ПЕКТИНОВЫЕ ВЕЩЕСТВА КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЫ Silene vulgaris (M.) G.
© 2011 г. Е. А. Гюнтер, Ю. С. Оводов
Институт физиологии Коми научного центра УрО РАН, Сыктывкар, 167982 e-mail: gunter@physiol.komisc.ru Поступила в редакцию 06.09.2009 г.
Из каллусной культуры смолевки обыкновенной Silene vulgaris, (M.) G. выделена пектин-белковая фракция SVC, в составе которой в качестве основных компонентов содержались остатки D-галактуро-новой кислоты, галактозы, арабинозы, рамнозы и белка. С помощью методов ионообменной хроматографии, ультрафильтрации, кислотного и ферментативного гидролиза показано, что SVC содержал смесь молекул линейного пектина, разветвленного пектинового полисахарида и пектин-белкового полимера. Фрагмент линейной цепи галактуронана составлял более половины всей углеводной цепи силе-нана. Разветвленная область макромолекулы представлена рамногалактуронаном I. Пектин-белковый полимер состоял в основном из слабо разветвленных пектиновых фрагментов с молекулярной массой более 300 кДа и белка.
Пектины являются основным компонентом первичных клеточных стенок высших растений и играют важную роль в регуляции пористости структуры и механических свойств клеточной стенки, а также участвуют в регуляции процессов роста и развития растений [1]. Пектины представляют собой галактуронаны и рассматриваются, как полимеры D-галактуроновой кислоты, которые имеют линейные области галактуронана и рамногалактуронана (smooth regions) и разветвленные области (hairy regions), представленные рамногалактуронаном I и рамногалактуронаном II (RGI и RGII), с боковыми цепями из галактана, арабинана, арабиногалакта-нов и других более сложных фрагментов [1—3].
Кроме того, различают смешанные углеводсодер-жащие биополимеры (гликоконъюгаты), которые, наряду с полисахаридными цепями, содержат полипептидные, белковые или липидные фрагменты. Достаточно хорошо изученными гликоконъюгатами являются арабиногалактановые белки (АГБ), которые обнаружены практически во всех растениях [4]. Они вовлечены в ряд фундаментальных процессов, связанных с развитием растительных клеток (пролиферация и растяжение клеток, соматический эмбриогенез). АГБ являются макромолекулами со сложной структурой, которые содержат более 90% углеводов (арабиногалактан II) и 2—10% белков. Ара-биногалактановые цепи присоединены ковалентны-ми связями к остаткам гидроксипролина, серина или треонина полипептидного кора. В настоящее время нет прямых доказательств существования пектин-белковых комплексов. Однако с помощью атомно-силовой микроскопии (АСМ) было впервые показано, что экстракт пектина, полученного из сахарной свеклы, содержит смесь линейных молекул пектина, разветвленного пектинового полисахарида и комплекса пектина с белком, присоединенным к од-
ному концу пектиновой цепи [5]. Ранее высказывалось предположение о наличии ковалентной связи между пектином и белком [6]. Полученные с помощью АСМ данные подтверждают это предположение, однако не являются прямым доказательством наличия этой связи: не исключается возможность физической ассоциации пектина и белка. Необходимо дополнительное исследование, чтобы идентифицировать тип пектин-белковой связи в комплексах, определить роль пектина и белка в комплексе и в растительной клеточной стенке [5].
Предварительные исследования, проведенные нами, показали, что силенан, пектин каллуса смолевки обыкновенной [Silene vulgaris (M.) G., Oberna behen (L.) I.], экстрагируется совместно с белками. Однако изучение строения пектин-белковых полимеров до настоящего времени не проводилось.
Установлено, что макромолекула силенана состоит из линейных и разветвленных областей [7]. Линейная область представлена а-1,4^-галактурона-ном и а-1,2-рамно-а-1,4^-галактуронаном, который одновременно является главной углеводной цепью разветвленной области силенана — рамнога-лактуронана I. Боковые цепи разветвленной области построены из остатков а-1,5-связанной арабинофу-ранозы и р-1,3-, р-1,4-, р-1,6-связанной галактопи-ранозы [8]. Изучены качественные и количественные изменения полисахаридов в течение ростового цикла культуры смолевки [9], а также показано влияние гормональных факторов [10], углеводов [11, 12], кальция, фосфата, азота [13] и ультрафиолетового облучения [14] на рост клеток и продуцирование полисахаридов. Показана иммуномодулирующая активность силенана каллусной культуры смолевки, в частности, усиление поглотительной способности и миелопероксидазной активности фагоцитов пери-
ферической крови человека и макрофагов брюшной полости крыс [15].
Ранее было показано, что каллусные и суспензионные культуры смолевки обыкновенной продуцируют близкие по строению пектины [16]. Сходство в строении пектинов позволяет применять каллусные культуры как исходный материал при масштабировании процесса получения биологически активных пектиновых веществ. В связи с этим каллусные культуры с высоким содержанием полисахаридов являются перспективным источником для получения суспензионных культур и создания на их основе линий—продуцентов ценных соединений для медицины, косметики, пищевой промышленности и для сельского хозяйства.
Применение культур клеток растений позволит получать пектин-белковые комплексы, характеризующиеся заданным строением и свойствами и стандартизованные по химическому составу и биологической активности. Клеточные культуры, продуцирующие в большом количестве физиологически активные пектин-белковые полимеры, могут служить альтернативным сырьевым источником для получения новых ценных гликоконъюгатов без ущерба природным популяциям.
Цель работы — получение и общая химическая характеристика пектиновых веществ, продуцируемых каллусной культурой смолевки обыкновенной.
МЕТОДИКА
Условия культивирования каллусной культуры.
Каллусную культуру смолевки обыкновенной [Silene vulgaris (M.) G.= Oberna behen (L.) I.] выращивали на агаризованной модифицированной среде Мурасиге и Скуга [17] с добавлением ауксина — 2,4-дихлорфе-ноксиуксусной кислоты (1.0 мг/л) и цитокинина — 6-бензиламинопурина (0.5 мг/л). Каллус субкульти-вировали с интервалом в 21 сут при 26 ± 1°С в темноте.
Общие аналитические методы. В полисахарид-ных фракциях определяли содержание гликуроно-вых кислот (ГУК) по реакции с 3,5-диметилфено-лом в присутствии концентрированной серной кислоты [18], содержание белка — методом Лоури. Спектрофотометрические измерения проводили на приборе Ultrospec 3000 ("Pharmacia Biotech", Великобритания). Газожидкостную хроматографию (ГЖХ) выполняли на приборе Hewlett-Packard 4890А ("Hewlett-Packard", США) с пламенно-ионизационным детектором и интегратором НР 3395А на капиллярной колонке RTX-1 (0.25 мм х 30 м) ("Restek", США), газ-носитель — аргон. Все растворы концентрировали в вакууме на роторном испарителе при 40—50°С. Центрифугирование растворов проводили при 6000 g в течение 15 мин. Полиса-харидные фракции лиофилизовали на лиофильной сушке ("VirTis", США).
Выделение полисахаридов. Выделение полиса-харидных фракций из каллуса проводили по методике, описанной в работе [16]. В результате получили пектин-белковую фракцию из каллусной культуры смолевки обыкновенной (SVC).
Полный кислотный гидролиз. Полисахаридные фракции (по 2.0—2.5 мг) гидролизовали 2 М три-фторуксусной кислотой (0.5 мл) при 100°С в течение 3—4 ч. Гидролизаты упаривали в вакууме с метиловым спиртом до полного удаления трифторуксус-ной кислоты. В качестве внутреннего стандарта использовали мио-инозит (0.5 мг/мл). Моносахариды идентифицировали с помощью ГЖХ в виде соответствующих ацетатов полиолов [19].
Ионообменная хроматография на ДЭАЭЦ. Полисахаридные фракции растворяли в небольшом количестве воды и наносили на колонку (1.5 х 43 см) с ДЭАЭЦ (ОН--форма, скорость элюции 54 мл/ч). Элюцию осуществляли последовательно водными растворами 0.01, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5 и 1.0 М хлорида натрия. Фракции отбирали по 10 мл. Выход полисахарида контролировали по реакции на углеводы с фенолом в присутствии концентрированной серной кислоты [20]. Объединенные фракции, соответствующие отдельным пикам, диализовали, концентрировали и лиофилизовали.
Молекулярно-массовое распределение полисахаридов. Полисахариды (30—60 мг) растворяли в дистиллированной воде (100—150 мл) и последовательно разделяли по молекулярной массе в ультрафильтрационной ячейке ("Millipore", США) с помощью ультрафильтрационных мембран (по-лисульфон, "Владисарт", Россия) с различными размерами пор (300, 100, 50 и 10 кДа). Фракции концентрировали и лиофилизовали. В результате получали фракции с молекулярными массами более 300 кДа (SVC-I); с молекулярными массами 100—300 кДа (SVC-II) и с молекулярными массами 50-100 кДа (SVC-III).
Жесткий кислотный гидролиз. Фракцию SVC (100 мг) гидролизовали 2 М трифторуксусной кислотой (20 мл) при 100°С в течение 5 ч. Полученный осадок отделяли центрифугированием, промывали этанолом трижды, затем растворяли в воде с добавлением 1 М аммиака до рН 5.0 и лиофилизовали. В результате жесткого кислотного гидролиза получили полисахаридный фрагмент (SVC-G) (выход 54%).
Ферментативный гидролиз. Ферментативный гидролиз пектина SVC из каллуса смолевки проводили с помощью пектиназы (а-1,4-Э-галактопира-нозилуроназы, КФ 3.2.1.15, Sigma, 753 ед./г, оптимум рН 4.0 при 25°С) с преобладающей эндо-актив-ностью. Фракцию SVC (150 мг) растворяли в 15 мл дистиллированной воды и добавляли водный раствор пектиназы (3 мг). Смесь инкубировали в течение 6 ч при 25°C, рН 4.0. Действие фермента останавливали путем кипячения инкубационной смеси, полученный осадок удаляли центрифугированием.
92
ГЮНТЕР, ОВОДОВ
Таблица 1. Характеристика полисахаридных фракций SVC, полученных в результате фракционирования на ДЭАЭЦ и ультрафильтрации
Фракция
Выход, %
Нейтральные моносахариды, %
Гал Ара Рам Глю Кси Ман сумма
SVC 10.6* 1.7 1.4 0.9 0.7 0.5 0.7 5.9 63.5 11.6
SVC-1 21.5** 3.4 3.2 2.0 2.0 0.3 0.5 11.4 65.0 7.7
SVC-2 14.7** 2.6 1.7 1.6 1.4 0.2 0.3 7.8 76.2 3.5
SVC-I 77 1*** 1.6 1.7 1.2 0.4 0.3 0.5 5.7 81.9 14.1
SVC-II 0 8*** 10.8 5.1 2.7 2.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.