БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.5, c.852-862
БИОФИЗИКА КЛЕТКИ
УДК 577.352.27
ПЕР ЕХОДНЫЕ П P ОЦЕССЫ В МОДЕЛЬНЫХ ЛИПИДНЫХ МЕМБРАНАХ Stratum corneum СО СМЕСЬЮ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
© 2009 г. Н.Ю. Рябова* **, М.А. Киселёв*, А.М. Балагуров*
*
Объединенный институт ядерных исследований, 141980, Дубна, Московская область, ул. Жолио-Кюри, д. 6;
**
Научно-исследовательский институт ядерной физики им. Д.В. Скобельцына Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, ГСП-1, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2
Поступила в p едакцию 16.04.09 г.
Методом дифракции нейтронов исследована гидратация модельных липидных мембран на о снове церамида 6 с жирными кислотами, наиболее распр о стр аненными в нативной липидной матр ице Stratum согпеит, верхнего слоя кожи млекопитающих. Гидр атация мембр аны пар ами воды при 25°C характер изуется очень малым изменением пер иода ламеллярной структур ы Ado = 1,0 А, сравнимым с величиной набухания модельных мембран Stratum согпеит в избытке воды. Кинетика изменения периода повторяемости, связанная с увеличением водной пр о слойки между бислоями в процессе гидратации, и водный обмен в процессах гидратации при 25°C и изотопического замещения воды со стоят из быстрой начальной и последующей медленной стадий. Оба кинетических процесса (гидратация и водный обмен) хорошо описываются экспоненциальными зависимостями с двумя хар актерными временами в диапазоне от нескольких десятков до нескольких сотен минут. В пр оцессе гидратации пр и 57°C мембрана набухает на Ado = 1,6 А, после чего происходит расслоение системы на две структурные фазы, одна из которых характеризуется большим изменением периода повторяемости Adph = 8,3 А при дегидратации и образована, вероятно, преимущественно длинноцепочечными жирными кислотами. Исследование структуры модельных мембран в температурном диапазоне 20-72°C показало, что мембр ана с 20% (масс.) холестер ина претер певает фазовый переход, связанный с «плавлением» углеводородных цепочек липидов в области 63-67°C. В системе с меньшим содержанием холестерина фазовый переход не наблюдается вплоть до температуры 72°C.
Ключевые слова: верхний слой кожи Stratum согпеит; модельные липидные мембраны; гидратация; фазовый переход; нейтронная дифракция.
Верхний слой кожи млекопитающих (Stratum согпеит, SC), состоящий из о роговевших клеток (корнеоцитов), находящихся в липидной матрице, является барьером для проникновения веществ чер ез кожный покр ов. ^гласно современным представлениям, главным путем диффузии веществ (воды, фар мацевтических и косметических растворов) через SC является ли-пидная матрица. Основными компонентами ли-пидной матрицы SC являются церамиды (девять стр уктурно различных типов), холестерин, свободные жирные кислоты и производные холестер ина. Cвойcтва и ор ганизация со ставляющих ее липидов играют решающую роль в барьерных функциях кожи. C помощью электронной микроскопии было показано, что липидная матрица SC имеет ламеллярную организацию с
Cокpащения: SC - Stratum соrneum, верхний слой кожи млекопитающих.
периодом повторяемости около 130 А [1,2]. Рентгенодифракционное исследование БС млекопитающих [3], а также смесей липидов, выделенных из БС [4], показало, что липиды БС организуют две ламмелярные фазы с периодичностью около 64 и 130 А. В работе [5] была пр едложена «сэндвич»-модель липидной матр и-цы, согласно которой, церамиды типа 1 и 4 с длинной углеводородной цепочкой играют основную роль в формировании длиннопериод-ной (130 А) структуры БС. В последние годы было предложено еще несколько теоретических моделей матрицы БС, объясняющих результаты многочисленных исследований ее организации [6]. Однако ни одна из предложенных моделей не описывает в полной мер е структуру и свойства реальной липидной матрицы БС.
Эффективным методом получения информации о липидной матр ице БС является изучение модельных липидных систем - смесей син-
тетических или выделенных из БС наиболее распр остраненных в БС липидов. Хотя модельные мембраны не могут полностью симулировать комплексную липидную матр ицу, изучение модельных систем с известным составом делает возможным охарактеризовать влияние отдельных липидов на структур ную организацию ли-пидных бислоев БС. Уже показано, что применение дифракции нейтронов является эффективным методом исследования модельных мембран с церамидами 1 и 6 [7-10]. В частности, установлено, что мембраны на основе корот-коцепочечного церамида 6 характеризуются малым межмембранным расстоянием, которое в избытке воды составляет всего 1,2 А [7]. Для объяснения этой особенности была пр едложена гипотеза арматурного укрепления соседних бис-лоев полностью протяженной конформацией молекул церамида 6, стягивающей со седние бис-лои до стерического контакта друг с другом [7,11]. О стабильности структуры, обр азованной цер амидом 6, свидетельствуют результаты экспериментов с модельными системами, приготовленными из церамида 1 и смеси цер амида 1 и церамида 6, в которых не была найдена стр уктурная фаза с периодичностью 130 А, как следовало ожидать, исходя из исследований Боустры и соавторов, на основе которых и была построена «сэндвич»-модель [10]. Недавно была изучена структура и гидратация модельных мембран на основе церамида 6 со смесью шести, наиболее распространенных в липидной матрице БС, жирных кислот. Установлено, что мембраны на основе композиции жирных кислот имеют структуру, близкую к структуре мембраны на основе одной пальмитиновой кислоты (далее «БС_РА-мембраны»). Вариация пр оцентного содер жания главных компонент в диапазоне температур 20-32°С существенно не изменяет стр уктурные параметр ы мембраны. В ходе исследования кинетики набухания мембраны в избытке воды было обнаружено, что композиция жирных кислот ускоряет гидратацию мембраны: как и в случае мембраны на основе пальмитиновой кислоты набухание мембраны хорошо описывается экспоненциальной зависимостью, но с характерным временем кинетического процесса 64 мин, что в полтора раза меньше характерного времени набухания БС_РА-мембраны.
Одним из вопросов изучения липидных систем, моделирующих липидную матрицу верхнего слоя кожи, является исследование их фазовых диаграмм и диффузионных процессов в этих системах. Температурное поведение модельных систем БС тр адиционно изучается методами дифференциальной сканирующей кало-
риметрии, инфракрасной спектр оскопии, ядерно-магнитного резонанса, рентгеновской дифракции. Было установлено, что фазовый переход, связанный с переходом бислоя из геле-вого со стояния в жидкокристаллическое, как в нативном слое БС, так и в модельных системах пр оисходит в области 60-80°С (см., например, обзор в работе [12]). Увеличение текучести бис-лоев при фазовом переходе сопровождается увеличением коэффициента диффузии воды и лекарственных растворов через липидную матрицу БС (см., обзор в работе [13]). Ниже температуры фазового перехода липиды нативного слоя БС и модельные системы хар актеризуются полиморфным поведением, зависящим от природы и процентного соотношения липидов [14,15].
Определение температуры фазового перехода в многокомпонентных системах часто бывает затруднено. Например, содержание холестерина в липидных смесях «размывает» область фазового перехода и делает невозможным точное определение температуры перехода системы из гелевого состояния в жидкокристаллическое. Как было недавно показано, анализ восстановленного из дифракционной картины модельных многокомпонентных мембран БС распределения плотности длины рассеяния нейтронов дает возможность наблюдать наличие фазового перехода в этих системах [16]. П ред ставленные в работе [17] результаты по изучению структурных изменений в многослойных фосфолипид-ных мембранах в пр оцессах их гидратации-дегидратации показывают, что измерение нейтронных дифракционных спектров в режиме реального времени (далее будем называть «дифракция в реальном времени») может быть эффективным методом исследования кинетики переходных процессов в многокомпонентных мембранах БС, характерные времена которых составляют порядка 100 мин.
В работе мы применили метод нейтронной дифракции в реальном времени для изучения температурного поведения структуры модельных мембран на основе церамида 6 со смесью жирных кислот при гидратации, а также определения зависимости температуры фазового перехода от процентного соотношения главных компонентов мембраны.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
К-(а-гидроксооктадеканоил)-фитосфингозин (церамид 6, СЕИ6) был синтезир ован фирмой Cosmoferm (Нидерланды). Холестерин (СЬ), сульфат холестер ина (СЬБ) и жир ные кислоты (БТА) приобретены в фирме 81§та-АЫпсЬ
(США). Кварцевые пластины 8рес1;го8П 2000 пр иобретены в компании 8ат1>ОоЬат (Германия), тяжелая вода (чистота 99,8%) была приобретена в фир ме «Изотоп» (Санкт-Петер бург).
Для дифракционных экспериментов по исследованию структуры модельных липидных мембран БС в диапазоне температур 20-72°С были приготовлены два образца с разными весовыми соотношениями компонент 55% СЕИ 6/20% СИ/15% Б Б А/10% СЬБ и 66% СЕИ 6/10% СЬ/18% РРА/15% СЬБ. Для приготовления смеси жирных кислот РРА были использованы наиболее распространенные в липидной матрице БС млекопитающих пальмитиновая (С 16:0), стеариновая (С 18:0), арахиновая (С20:0), беге-новая (С22:0), лигноцериновая (С24:0) и церо-тиновая (С26:0) кислоты в мольном соотношении: С 16:0/С 18:0/С20:0/С22:0/С24:0/С26:0 = 1.3/3.3/6.7/41.7/36/6.7. Для дифракционных экспериментов по исследованию кинетики гидратации модельных липидных мембран БС был приготовлен образец 55% СЕИ 6/20% СЬ/15% ЬРРА/10% СЬБ со смесью кислот ЬРРА, представленной только длинноцепочечными жирными кислотами в мольном соотношении: С22:0/С24:0/С26:0 = 8.8/7.7/1.4.
Для получения образца использовалась стандартная процедура приготовления ориентированной липидной мембраны на подложке [18]. Около 2,4 мл 10% раствора липидов в органическом растворителе (хлороформ/метанол в массовом отношении 2/1) выливались на кварцевую пластину площадью 65 X 25 мм. Образец высушивался при комнатной температуре и на 12 ч помещался в вакуум для удаления остатка раств
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.