БИОФИЗИКА, 2009, том 54, вып.4, c.589-593
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА
УДК 577.3
ПЕРИОДИЧНОСТИ В ОРГАНИЗАЦИИ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ЛОКУСА ЛЕГКОЙ ЦЕПИ ИММУНОГЛОБУЛИНОВ Gallus gallus
© 2009 г. Г.И. Кравацкая, Ю.В. Кравацкий, А.С. Благодатский, В.Г. Туманян,
Н.Г. Есипова
Учpеждение P оссийской академии наук Институт молекуляpной биологии им. В .А. Энгельгардта PАН,
119991, Москва, ул. Вавилова, 32 Поступила в p едакцию 09.12.08 г.
Методами поиска тандемных повтор ов и Фур ье-анализа исследованы пер иодичности в нук-леотидной последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов Gallus gallus. Получено распределение периодичностей в последовательностях нуклеотидов вдоль 15-й хромосомы курицы Gallus gallus методом Фурье-анализа. Показана уникальность Фурье-спектр а нуклео-тидной последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов. Уникальность Фур ье-спек-тра по разработанным оригинальным критериям свойственна также отдельным фрагментам этого локуса р азной длины: вариабельной области, константной области, области энхансер а и некоторым другим фрагментам локуса. Высказана гипотеза о связи уникальности регуля-торных областей локуса и функции индуцирования соматического гипермутирования.
Ключевые слова: Gallus gallus, Фурье-анализ, локус легкой цепи Ig, соматическое гипермутирование
В работах [1-3] мы показали, что периодичность в распр еделении нуклеотидов сама по себе вне зависимости от конкретной последовательности нуклеотидов может быть связана с функционированием регуляторых областей генома, так как именно периодичность в распределении нуклеотидов (НК) - важнейшая основа для формирования потенциала НК-белковых взаимодействий, т.е. для распознавания определенных областей генома. В работе [4] показано, что на основе сходства Фурье-спектр ов различных негомологичных участков генома можно выявить несколько областей с аналогичной функцией, а именно областей, вовлеченных при определенных условиях в процесс инициации репликации.
Соматическое гипермутирование - процесс, характерный для позвоночных животных, необходимый для производства В-лимфоцитами антител с повышенным сродством к антигену. Это достигается за счет повышения частоты мутаций в вариабельных областях иммуногло-булиновых локусов до порядка 10-3 мутаций на пару оснований на одно деление клетки, что в 10б раз больше, чем частота спонтанных мутаций в соматических клетках [5] с последующим положительным отбором лимфоцитов, пр оизводящих высокоаффинные антитела. У од-
Сокращение: GFP - зеленый флуоресцентный белок.
них видов позвоночных (мышь, человек) соматическое гипер мутир ование может встречаться само по себе, у других (кролик, свинья, птицы) оно происходит параллельно с генной конверсией - изменением первичной стр уктуры вариабельных областей иммуноглобулиновых генов путем обмена участками по механизму гомологичной рекомбинации с расположенными выше псевдогенами.
Было выяснено [6], что удаление у курицы псевдогенов, служащих матрицей для генной конверсии, приводит к замене последней соматическим гипермутированием. Это позволяет использовать курицу или культуры куриных В-лимфоцитов в качестве удобного модельного объекта для изучения соматического гипермутирования, поскольку локус легкой цепи иммуноглобулинов у нее очень компактен и после удаления псевдогенов имеет размер около 10 тыс. пар оснований.
В исследованиях соматического гипермутирования важную роль играет вопрос о механизмах ограничения его действия вариабельными областями иммуноглобулиновых локусов. В самом деле, аберрантное гипермутирование, распр остраняющееся на неиммуноглобулино-вые гены, способно привести к летальным для клетки последствиям или же к канцерогенезу [7]. Гипермутируемая последовательность должна быть активно транскрибируемой [8], однако
активная транскр ипция не является достаточно жестким условием, способным ограничить область соматического гипермутирования имму-ноглобулиновыми генами. Известно также, что в роли пускового фактора для соматического гипермутирования выступает цитидиновая де-заминаза AID, однако сам этот фермент не показал пр едпочтения к какой-либо последовательности ДНК, поэтому предполагается, что он работает в комплексе с не выявленными пока транс-регуляторными факторами, отвечающими за избирательность его действия только на вариабельные участки иммуноглобули-новых генов [5]. И сходя из этого, подразумевается наличие в локусах иммуноглобулиновых генов цис-регуляторных последовательностей, достаточно уникальных для того, чтобы обеспечить специфику взаимодействия с белками, отвечающими за соматическое гипер мутир ова-ние.
Поскольку соматическому гипер мутир ова-нию подвергаются не только гены вариабельных областей иммуноглобулинов, а любые активно транскр ибир уемые тр ансгенные последовательности, интегрированные в иммуноглобу-линовый локус [6], стало возможно создание репортерной конструкции на основе зеленого флуоресцентного белка (GFP) [9]. Будучи интегрирован в локус легкой цепи иммуноглобулинов кур ицы, ген GFP подвергается гипермутированию. П ри р аботе с культур ой кур иных В-лимфоцитов DT40 можно оценить интенсивность гипермутирования с помощью GFP-ре-портерной конструкции, экспрессируемой в им-муноглобулиновом локусе, подсчитывая процент клеток со сниженной за счет мутаций интенсивностью «зеленой» флуоресценции [5].
П р и помощи вышеописанного метода в работе [5] был проведен анализ, в ходе которого были выявлены последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы, обладающие способностью полноценно или частично индуцировать гипермутабельность в соседствующем с ними репортерном гене.
Предполагают, что специфическая направленность соматического гипермутирования исключительно на вариабельные области имму-ноглобулиновых генов достигается комбинированным действием нескольких элементов имму-ноглобулинового локуса, часть из которых, вероятно, взаимозаменяема [10]. Авторы работы [11] выявили внутри локуса легкой цепи иммуноглобулинов кур ицы так называемый 3'RR-сегмент длиной порядка 4 тыс. нуклеотидов, маркирующий гены Ig локуса как мишень для локализованного мутагенеза. При прямом сравнении нуклеотидной последовательности этого
сегмента c иммуноглобулиновыми локусами легкой и тяжелой цепей других позвоночных не удалось обнаружить высококонсер вативных участков. Таким образом, остается актуальной задача поиска новых характеристик нуклеотид-ной последовательности, ответственной за специфическую направленность соматического гипер мутир ования. В данной работе мы поставили задачу детального анализа периодичностей в нуклеотидной последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов кур ицы, предполагая, что уникальность регуляторной функции может отражаться в уникально сти Фурье-спектр ов соответствующих нуклеотидных последовательностей.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Нуклеотидная последовательность W (так называемый DIVAC [10]), содержащая все последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы Gallus gallus, кроме псевдогенов, и обладающая высокой гипермутабель-ной способностью, взята из базы данных GenBank (FJ482234, нуклеотиды с 13 до 9796-го). Фрагмент S, являющийся частью последовательности W и обладающий средней гиперму-табельной активностью, содержит нуклеотиды от 3123-го до 7124-го последовательности FJ482234. Ф р агмент Р «Р», также являющийся частью региона «W» и не обладающий гипер-мутабельной активностью, содержит нуклеоти-ды от 7125-го до 9808-го последовательности FJ482234.
Нуклеотидная последовательность 3'RR ([13]) р егулятор ного участка локуса легкой цепи иммуноглобулинов кур ицы, усиливающего соматическое гипермутирование, взята из базы данных GenBank (AC171016, нуклеотиды с 113822-го до 117952-го). Нуклеотидная последовательность 15 хромосомы Gallus gallus взята на сайте NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).
Для вычисления Фурье-спектр ов нуклеотидных последовательностей Ю .В. К равацким написана пр ограмма Fournew, котор ая представляет собой специальную версию программы Fo-urAn [12], позволяющую организовывать параллельные вычисления. Параллельные вычисления в программе реализованы с помощью библиотеки OpenMP, что дает возможность использовать все имеющиеся на локальном компьютере процессоры и все их вычислительные ядра. Фурье-анализ произведен по методу [13]. Также специальная программа написана для сравнения Фурье-спектров разных нуклеотидных последовательностей и исследования уникальности Фурье-спектров иммуноглобулино-
ПЕРИОДИЧНОС ТИ В ОРГАНИЗАЦИИ
591
вого локуса и его фр агментов. Алгор итм аналогичен использованному нами ранее в работе [4], но Фур ье-спектр ы были получены по методу [13], а не по методу [14], как это было в работе [4]. Близость Фур ье-спектр ов мы оценивали по евклидовому расстоянию между соответствующими компонентами спектр ов.
Поиск тандемных повтор ов в нуклеотидной по следовательно сти локуса пр оизведен с помощью программы Tandem Яереа18 Finder [15], находящейся в свободном до ступе по адр есу: a^.biomath.mssm.edu/trf.html.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Методом скользящего окна со сдвигом на 10 нуклеотидов получен набор распределений Фур ье-спектр ов нуклеотидных последовательно стей вдоль 15-й хромосомы. Процедура по-вто р ялась для размер ов окна, соответствующих длине энхансер а иммуноглобулинового локуса, длине вариабельной области, длине константной области, длине всего локуса W и длинам его фр агментов Б, Р, т .е. р азмер окна менялся от величин по рядка нескольких сотен нуклеотидов до нескольких тысяч нуклеотидов.
Также Фурье-анализу были подвергнуты: р егион <^» пр отяженностью 9,8 тыс. п .о., со -дер жащий в се последовательности локуса легкой цепи иммуноглобулинов курицы, кроме псевдогенов, и обладающий высокой гиперму-табельной активностью; уча сток «Б» пр отяжен-ностью 4002 п.о., являющийся частью региона <^», и уча сток «Р» пр отяженностью 2684 п.о., также являющийся частью региона <^» и не обладающий гипер мутабельной активностью.
На р ис. 1а пр иведен Фур ье-спектр в алфавите {А,С,в,Т} локуса W. Числа около стрелок - длины пер иодов, соответствующие неко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.